O Western blotting é um dos procedimentos mais comuns em laboratórios bioquímicos. Basicamente, ele separa as proteínas de uma amostra por tamanho e, em seguida, testa usando anticorpos para determinar se uma determinada proteína está presente. É útil não apenas em pesquisas, mas também em laboratórios médicos ou de diagnóstico; os testes para HIV e doença de Lyme, por exemplo, envolvem um teste de imunoabsorção enzimática (ELISA), seguido por um Western blot se o teste de ELISA for positivo. Apesar de sua popularidade, no entanto, o Western blotting tem várias desvantagens.
Não quantitativo
Os Western blots clássicos não são quantitativos. Em outras palavras, embora possam dizer aos pesquisadores se uma determinada proteína está presente, eles não permitem quantificar quanto da proteína está presente. Algumas empresas de biotecnologia agora vendem kits que permitem aos pesquisadores ou técnicos de laboratório quantificar a quantidade de proteína presente usando uma curva padrão - mas isso funciona apenas se amostras puras da mesma proteína são acessível. Além disso, o peso molecular de uma proteína só pode ser estimado com Western blotting, em vez de determinado precisamente como com espectrometria de massa.
Anticorpos
Um Western blot só pode ser realizado se os anticorpos primários contra a proteína de interesse estiverem disponíveis. Embora os anticorpos para muitas proteínas diferentes estejam disponíveis nas empresas de biotecnologia, eles não são baratos; se os anticorpos primários não estiverem disponíveis para uma determinada proteína, não será possível realizar um Western blot procurando essa proteína em particular. Além disso, os pesquisadores podem querer determinar se uma proteína foi modificada de alguma forma - se foi fosforilada (teve um grupo fosfato ligado a ele), por exemplo - e com a técnica de Western blot eles precisam de anticorpos específicos para o proteína.
Treinamento
Pode ser desafiador realizar um Western blot adequadamente e obter bons resultados, portanto, a equipe deve ser bem treinada. Nisto, como em muitas outras coisas, a experiência é talvez o melhor tutor; mesmo para um técnico experiente, entretanto, um Western blot é demorado. A parte de eletroforese em gel do experimento, por exemplo, normalmente levará de uma a duas horas para ser executada. Outras tarefas podem ser realizadas enquanto o gel está em execução, é claro, mas o experimento ainda leva algum tempo para obter resultados.
Outras Limitações
Os anticorpos podem, às vezes, exibir alguma ligação fora do alvo, o que pode levar a resultados piores. Além disso, com o Western blotting, você usa um anticorpo contra uma proteína específica, de modo que seus resultados apenas lhe dirão se essa proteína estava presente. A espectrometria de massa de alta resolução, por outro lado, revela todas as proteínas presentes em uma amostra e, ao contrário do Western blotting clássico, é quantitativa. É importante lembrar, é claro, que a espectrometria de massa é muito mais cara e também mais desafiadora do ponto de vista técnico em comparação com o Western blotting.
