A eletroforese em gel é uma técnica em que as moléculas biológicas são separadas umas das outras e identificadas em pesquisas biológicas ou diagnósticos médicos. Desde seu desenvolvimento na década de 1970, essas técnicas têm sido inestimáveis na identificação de genes (DNA) e produtos gênicos (RNA e proteínas) de interesse de pesquisa. Nos últimos anos, surgiram novas técnicas que fornecem maior especificidade e detalhes sobre o que está acontecendo nos sistemas vivos. Embora essas técnicas não tenham suplantado as técnicas de eletroforese e as manipulações avançadas possam expandir a viabilidade da técnica, é importante perceber o que a eletroforese em gel pode e não pode fazer.
Eletroforrese Tem Análise de Amostra Limitada
A eletroforese é específica para qualquer tecido que você tenha amostrado. Por exemplo, se você executar um Southern blot (um tipo de eletroforese) em um esfregaço de bochecha, estará observando genes das células epiteliais de sua bochecha e de nenhum outro lugar de seu corpo. Às vezes, isso pode ser benéfico, mas os pesquisadores frequentemente estão interessados em efeitos mais abrangentes.
Técnicas como a hibridização in situ (ISH) podem pegar uma seção do tecido e analisar a expressão do gene em cada pequena área dessa amostra. Assim, os pesquisadores podem olhar para cada área do cérebro em uma amostra com ISH, enquanto as técnicas de eletroforese podem olhar apenas para algumas áreas de cada vez.
As medições de eletroforese não são precisas
A eletroforese em gel pode separar efetivamente proteínas semelhantes com pesos diferentes (essa é uma técnica chamada Western blotting). Ele pode separá-los com mais precisão por meio de uma técnica conhecida como eletroforese 2d; isso é comum em proteômica.
Infelizmente, todas as medições feitas com essa técnica são, na melhor das hipóteses, semiquantitativas. Para obter a massa precisa (peso) das proteínas, a espectroscopia de massa deve ser empregada após a proteína ter sido purificada por eletroforese. Além disso, a comparação das quantidades relativas de diferentes moléculas depende da densidade da banda (escuridão) de diferentes pontos no gel. Este método tem algum grau de erro e as amostras geralmente são executadas várias vezes para obter resultados limpos.
É necessária uma amostra inicial substancial
A eletroforese é uma técnica de isolamento e identificação visual de diferentes biomoléculas. Isso é feito passando uma corrente elétrica através do gel para separar moléculas carregadas de pesos diferentes. Se a molécula em que você está interessado não for comum o suficiente, sua banda será virtualmente invisível e difícil de medir.
O DNA e o RNA podem ser um pouco amplificados antes da eletroforese, mas não é prático fazer isso com proteínas. Portanto, uma grande amostra de tecido é necessária para executar esses ensaios. Isso pode limitar a utilidade da técnica, especialmente em análises médicas. É virtualmente impossível executar a eletroforese em amostras de uma única célula; a citometria de fluxo e a imuno-histoquímica são mais comumente usadas para avaliar a expressão de proteínas célula a célula. Uma técnica chamada PCR é excelente para medir com precisão pequenas quantidades de RNA.
Apenas certas moléculas podem ser visualizadas
A eletroforese é excelente para separar e identificar biomoléculas de médio a grande porte. No entanto, muitas das moléculas que os pesquisadores desejam observar são menores; pequenos hormônios, neurotransmissores e íons não podem ser medidos por eletroforese. Isso ocorre por dois motivos: eles não reagem adequadamente com a preparação de eletroforese (geralmente uma técnica chamado SDS PAGE) e, mesmo que o fizessem, eles são muito pequenos para separar adequadamente e iriam precipitar-se para fora do fundo do o gel. Em vez disso, essas moléculas são medidas por técnicas como RIAAs (radioimunoensaios) e ELISAs (ensaio de imunoabsorção enzimática).
Eletroforese é de baixo rendimento
A eletroforese em gel é geralmente de baixo rendimento, o que significa que não produz dados especialmente rapidamente. Eletroforese de contraste, onde você pode observar um pequeno punhado de moléculas de RNA por vez, com PCR (reação em cadeia da polimerase), que pode avaliar simultaneamente milhares de amostras. Da mesma forma, a citometria de fluxo pode fazer medições de milhares de células individuais e tornar complexas correlações, enquanto a eletroforese olha para as células em massa e não pode fazer tais discriminações. A PCR e a citometria de fluxo representam processos massivamente paralelos e seriais, respectivamente, e ambos ultrapassam em muito as habilidades da eletroforese para gerar dados de pesquisa.