As bactérias são cultivadas em placas de Petri em um meio sólido conhecido como ágar bacteriano, onde colônias circulares elevadas se formam. Ao contrário de uma célula bacteriana individual, uma colônia é um grupo de bactérias grande o suficiente para ser visível a olho nu. O crescimento bacteriano pode ser medido pela simples observação de quantas colônias estão presentes; no entanto, métodos mais quantitativos incluem o uso de uma câmara de contagem ou, mais frequentemente, contagens de placas viáveis. Este último é usado com mais frequência, pois também fornece informações qualitativas, como o efeito de diferentes condições de crescimento. Como pode haver bilhões de bactérias em uma placa de Petri, a medição primeiro requer diluir a amostra para que seja possível contar o número de colônias.
Em um tubo de ensaio, adicione 10 microlitros da cultura bacteriana inicial a 90 microlitros do meio de diluição. Feche bem a tampa do tubo e agite suavemente no vórtex para obter uma mistura homogênea. Agora, a amostra é um décimo de sua concentração original.
Transfira 10 microlitros desta nova amostra para um novo tubo de ensaio contendo 90 microlitros de meio de diluição e misture novamente. Mais uma vez, o resultado será a amostra ainda mais diluída - agora será um centésimo de sua concentração original. Repita várias vezes, até que a amostra original tenha sido diluída entre 104 e 1010 vezes. Certifique-se de que cada tubo esteja rotulado com a diluição correta, por exemplo 10-1, 10-2 e assim por diante.
Dispense 10 microlitros da última diluição completa na placa de ágar. Usando a borda de espalhamento, distribua a solução bacteriana em toda a superfície da placa de ágar. Repita isso para mais dois pratos. Também é comum realizar essas etapas com outros níveis de diluição para comparação. Certifique-se de rotular o fundo das placas. Recoloque as tampas em cada placa e deixe as placas de ágar secarem por vários minutos em uma bancada de laboratório sob uma chama ou em uma incubadora. Coloque as placas na incubadora, que deve ser ajustada para a temperatura adequada para a cepa de bactérias. Deixe crescer por 12 a 16 horas.
As colônias devem ser visíveis após 16 horas; no entanto, algumas modificações genéticas podem exigir mais tempo (por exemplo, desenvolvimento de cor). Quando as colônias forem observáveis, retire as placas e encontre aquelas que tenham entre 30 e 300 colônias. Usando um marcador permanente, coloque um ponto no fundo da placa de Petri - o lado com o ágar, não a tampa - onde quer que uma colônia seja visível através do ágar. Conte cada ponto do marcador. Repita para cada prato.
Para medir a quantidade de bactérias na cultura inicial para este experimento, a diluição precisa ser invertida nos cálculos, em dois locais. Em primeiro lugar, quando você tirou um microlitro do tubo de ensaio para colocar na placa de Petri, você tirou um décimo da amostra diluída, então você precisa multiplicar tudo por 10 para reverter isso. Além disso, se o fator de diluição no tubo de ensaio fosse, por exemplo, 10-7, então o número de colônias deve ser multiplicado por 107 a fim de reverter o efeito de diluição. Simplesmente remova o sinal negativo do expoente nos cálculos. Use a fórmula:
[Número de colônias contadas] × 10 × [quantas vezes a amostra deve ser multiplicada para chegar à concentração original: por exemplo, 105] = Número de unidades formadoras de colônias (CFU) por mililitro de cultura inicial. Este é o crescimento bacteriano em suas placas de Petri.