O que é a fratura por congelamento e por que ela é útil em biologia celular?

As membranas celulares consistem em fosfolipídios e proteínas anexadas ou embutidas. As proteínas da membrana desempenham papéis vitais no metabolismo e na vida da célula. Você não pode usar microscopia comum para visualizar ou caracterizar proteínas de adesão, proteínas de transporte e canais de proteínas na membrana celular. Usando microscopia eletrônica e uma técnica chamada "fratura por congelamento", que separa as membranas celulares congeladas, permite a visualização da estrutura da membrana e a organização das proteínas dentro do mar de fosfolipídios. Combinar outros métodos com a fratura por congelamento não só nos ajuda a entender a estrutura das diferentes membranas celulares e proteínas de membrana, mas permite a visualização e análise detalhada da função de proteínas, bactérias e vírus.

Usando nitrogênio líquido, as amostras de tecido biológico ou células são rapidamente congeladas para imobilizar os constituintes celulares. As membranas celulares são compostas por duas camadas de fosfolipídios, chamadas de bicamada, onde as caudas lipídicas hidrofóbicas, ou que odeiam água, apontam para o interior da membrana e as extremidades hidrofílicas, ou hidrófilas, da molécula de lipídeo apontam para fora e para dentro do célula. A amostra congelada é rachada ou fraturada com um micrótomo, que é um instrumento semelhante a uma faca para cortar fatias finas de tecido. Isso faz com que a membrana celular se separe precisamente entre as duas camadas, porque a atração entre as caudas lipídicas hidrofóbicas representa o ponto mais fraco. Após a fratura, a amostra é submetida a um procedimento a vácuo, denominado "condicionamento por congelamento". A superfície do fraturado amostra é sombreada com carbono e vapor de platina para fazer uma réplica estável, que segue os contornos da fratura plano. O ácido é usado para digerir o material orgânico que adere à réplica, deixando uma fina camada de platina da superfície da membrana fraturada. Esta casca é então analisada por microscopia eletrônica.

A decapagem por congelamento é a secagem a vácuo de uma amostra biológica não fixada, congelada e fraturada por congelamento. O procedimento de secagem a vácuo é semelhante à liofilização de frutas e vegetais que são embalados e vendidos em supermercados. Sem a decapagem por congelamento, muitos detalhes da estrutura celular são obscurecidos por cristais de gelo. A etapa de ataque profundo ou congelamento melhora e estende o método original de fratura por congelamento, permitindo a observação das membranas celulares durante várias atividades. Permite a análise não apenas da estrutura da membrana, mas também dos componentes intracelulares e fornece informações estruturais detalhadas sobre bactérias, vírus e grandes proteínas celulares complexos.

A microscopia eletrônica pode revelar e ampliar mais de um milhão de vezes os menores organismos ou estruturas, como bactérias, vírus, componentes intracelulares e até proteínas. A visualização é criada bombardeando uma amostra ultrafina com um feixe de elétrons. Os dois métodos de microscopia eletrônica são microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, e microscopia eletrônica de transmissão, ou TEM. Amostras de fratura por congelamento são rotineiramente analisadas com TEM. TEM tem melhor resolução do que SEM e oferece informações estruturais de até 3 nanômetros de réplicas.

O desenvolvimento e o uso da microscopia eletrônica de fratura por congelamento mostraram que as membranas plasmáticas das células são compostas por bicamadas lipídicas e esclareceu como as proteínas são organizadas dentro das membranas celulares. A fratura por congelamento oferece uma visão única do interior das membranas celulares, porque divide e separa os fosfolipídios da membrana em duas folhas ou faces opostas e complementares. Nos mais de 50 anos desde a introdução da primeira máquina de fratura por congelamento, fazer uma réplica de platina ainda é a única maneira de obter informações estruturais sobre a membrana celular. A técnica mostra se proteínas específicas flutuam ou estão ancoradas na membrana celular e se e como algumas proteínas se agregam. Um método mais novo - usando anticorpos que visam proteínas específicas - é combinado com a fratura por congelamento para identificar proteínas e sua função na membrana celular.