DNA-kloning: definisjon, prosess, eksempler

Det er mulig å klone hele organismer som sauen Dolly, men DNA-kloning er annerledes. Den bruker molekylærbiologiske teknikker for å lage identiske kopier av DNA-sekvenser eller enkeltgener.

Ved hjelp av gentekniske metoder identifiseres og isoleres segmenter av DNA-genetisk kode. DNA-kloning kopierer deretter nukleinsyre sekvenser i segmentene.

De resulterende identiske kopiene kan brukes til videre forskning eller til bioteknologiske applikasjoner. Ofte koder genet som kopieres for et protein som kan inngå i medisinske behandlinger. DNA-teknologi inkludert DNA-kloning støtter forståelsen av hvordan gener fungerer og hvordan menneskers genetiske kode påvirker kroppens funksjon.

DNA-kloning er den molekylære biologiprosessen for å lage identiske kopier av DNA-segmenter lokalisert i kromosomene som inneholder den genetiske koden til avanserte organismer.

Prosessen genererer store mengder av målrette DNA-sekvenser. Målet med DNA-kloning er å produsere mål-DNA-sekvensene selv eller å produsere proteiner kodet i målsekvensene.

De to metodene som brukes i DNA-kloning kalles plasmidvektor og polymerasekjedereaksjon (PCR). I plasmidvektor metode, blir DNA-tråder kuttet ved hjelp av restriksjonsenzymer for å produsere DNA-fragmenter, og de resulterende segmentene settes inn i kloningsvektorer kalt plasmider for ytterligere duplisering. Plasmidene plasseres i bakterieceller som deretter produserer DNA-kopiene eller kodede proteiner.

I PCR-metoden, er segmentet av DNA-tråder som skal dupliseres merket med enzymer som kalles grunning. Et polymeraseenzym lager kopier av den markerte delen av DNA-strengen. Denne metoden bruker ikke restriksjonsenzymer og kan produsere klonet DNA fra små prøver. Noen ganger brukes de to DNA-teknologimetodene sammen for å innlemme de beste egenskapene til hver i en totalreaksjon.

Metodens vektor refererer til plasmidet som brukes til å holde mål-DNA-segmentet som skal klones. Plasmider er små sirkulære tråder av ikke-kromosomalt DNA finnes i mange organismer, inkludert bakterier og virus.

Bakterielle plasmider er vektoren som brukes til å sette mål-DNA-segmentet inn i bakterieceller for ytterligere duplisering.

Velge og isolere mål-DNA: Før DNA-kloningsprosessen kan begynne, må DNA-sekvensene identifiseres, spesielt begynnelsen og endene av DNA-segmentene.

Slike DNA-sekvenser kan bli funnet ved å bruke eksisterende klonet DNA med kjente sekvenser eller ved å studere proteinet produsert av mål-DNA-sekvensen. Når sekvensen er kjent, kan de tilsvarende restriksjonsenzymer brukes.

Kutting av mål-DNA med restriksjonsenzymer: Restriksjonsenzymer er valgt for å lete etter DNA-koden i begynnelsen og slutten av målsekvensene.

Når restriksjonsenzymer finner en spesiell kodet sekvens av basepar som kalles restriksjonsseter, gjør de det feste seg til DNA på det stedet og vikle seg rundt DNA-molekylet, og kutte Strand. De kutte DNA-segmentene som inneholder målsekvensen er nå tilgjengelig for duplisering.

Velge plasmidvektoren og sette inn mål-DNA: Et passende plasmid inneholder ideelt sett de samme DNA-kodende sekvensene som DNA-strengen som mål-DNA ble kuttet fra. Den sirkulære DNA-strengen i plasmidet kuttes med de samme restriksjonsenzymer som ble brukt for å kutte mål-DNA.

EN DNA ligase enzym brukes til å fremme DNA-segmentkobling, og endene av mål-DNA-segmentet kobles sammen med de kutte ender av plasmid-DNA. Mål-DNA utgjør nå en del av den sirkulære plasmid-DNA-strengen.

Sette plasmidet inn i en bakteriecelle: Når plasmidet inneholder DNA-sekvensen som skal klones, kan den faktiske kloning finne sted ved hjelp av en prosess som kalles bakteriell transformasjon. Plasmidene settes inn i en bakteriecelle som E. coli, og cellene med de nye DNA-segmentene vil begynne å produsere kopier og de tilsvarende proteiner.

I bakteriell transformasjon blir vertscellene og plasmidene inkubert sammen ved kroppstemperatur i omtrent 12 timer. Cellene absorberer noen av plasmidene og behandler dem som sitt eget plasmid-DNA.

Høsting av klonet DNA og proteiner: De fleste plasmider som brukes til DNA-kloning har gener mot antibiotikaresistens innlemmet i deres DNA. Når bakteriecellene absorberer de nye plasmidene, blir de motstandsdyktige mot antibiotika.

Når kulturen behandles med antibiotika, er det bare de cellene som har absorbert de nye plasmidene som overlever. Resultatet er en ren kultur av bakterieceller med klonet DNA. Det DNA kan deretter høstes eller det tilsvarende proteinet kan produseres.

De PCR metoden er enklere og kopierer eksisterende DNA på plass. Det krever ikke kutting med restriksjonsenzymer eller innsetting plasmidDNA sekvenser. Dette gjør den spesielt egnet for kloning av DNA-prøver med et begrenset antall DNA-tråder. Selv om metoden kan klone DNA, kan den ikke brukes til produksjon av det tilsvarende proteinet.

Avvikling av DNA-strengene: DNA i kromosomer er tett kveilet i en dobbel helixstruktur. Oppvarming av DNA til 96 grader Celsius i en prosess som kalles denaturering gjør DNA-molekylet uncoil og skilles i to tråder. Denne separasjonen er nødvendig fordi bare en enkelt DNA-streng kan klones på en gang.

Velge primere: Som med plasmidvektor-DNA-kloning, må DNA-sekvensene som skal klones identifiseres med spesiell vekt på begynnelsen og endene av DNA-segmentene. Primere er enzymer som fester seg til spesifikke DNA-kodesekvenser, og de må velges for å markere mål-DNA-segmentene. De rette primerne vil feste seg til DNA-molekylsekvensene for å markere begynnelsen og endene på målsegmentene.

Annealing reaksjonen for å binde primere: Å avkjøle reaksjonen ned til omtrent 55 grader Celsius kalles gløding. Når reaksjonen avkjøles, aktiveres primerne og fester seg til DNA-strengen i hver ende av et mål-DNA-segment. Primerne fungerer bare som markører, og DNA-strengen trenger ikke å kuttes.

Produserer identiske kopier av mål-DNA-segmentet: I en prosess som heter Utvidelse, tilsettes det varmefølsomme TAQ-polymeraseenzymet til reaksjonen. Reaksjonen blir deretter oppvarmet til 72 grader Celsius, og aktiverer enzymet. Det aktive DNA-polymeraseenzymet binder seg til primerne og kopierer DNA-sekvensen mellom dem. Den første DNA-sekvenserings- og kloningsprosessen er fullført.

Øke utbyttet av klonet DNA: Den innledende annealing- og utvidelsesprosessen skaper relativt få kopier av de tilgjengelige DNA-strengsegmentene. For å øke utbyttet gjennom ytterligere DNA-replikasjon, blir reaksjonen avkjølt igjen for å aktivere primerne på nytt og la dem binde seg til andre DNA-tråder.

Deretter aktiverer reaksjonsoppvarmingen reaksjonen polymeraseenzymet igjen, og flere kopier blir produsert. Denne syklusen kan gjentas 25 til 30 ganger.

Plasmidvektormetoden er avhengig av en rikelig innledende tilførsel av DNA for å kutte og sette inn i plasmider. For lite originalt DNA resulterer i færre plasmider og en langsom start på klonet DNA-produksjon.

PCR-metoden kan produsere en stor mengde DNA fra få originale DNA-tråder, men fordi DNA ikke er implantert i en bakteriecelle, er ikke proteinproduksjon mulig.

For å produsere proteinet kodet i DNA-fragmentene som skal klones fra en liten initial DNA-prøve, kan de to metodene brukes sammen, og de kan utfylle hverandre. Først brukes PCR-metoden til å klone DNA fra en liten prøve og produsere mange kopier.

Deretter blir PCR-produktene brukt med plasmidvektormetoden for å implantere produsert DNA i bakterieceller som vil produsere ønsket protein.

Molekylærbiologi bruker genkloning og DNA-replikasjon for medisinske og kommersielle formål. Bakteriene med klonede DNA-sekvenser brukes til å produsere medisiner og erstatte stoffer som mennesker med genetiske lidelser ikke kan produsere selv.

Typiske bruksområder inkluderer:

• Genet for humant insulin er klonet i bakterier som deretter produserer insulinet som brukes av diabetikere.
• Vevsplasminogenaktivator produseres fra klonet DNA og brukes til å hjelpe forhindre blodpropp.
• Menneskelig veksthormon kan produseres og administreres til mennesker som ikke kan produsere det selv.

Bioteknologi bruker også genkloning i landbruket for å skape nye egenskaper hos planter og dyr eller forbedre eksisterende egenskaper. Etter hvert som flere gener blir klonet, øker antallet mulige bruksområder eksponentielt.

DNA-molekyler utgjør en liten brøkdel av materialet i en levende celle, og det er vanskelig å isolere påvirkningen fra de mange genene. DNA-kloningsmetodene leverer store mengder av en spesifikk DNA-sekvens for studier, og DNA produserer proteiner akkurat som det gjorde i den opprinnelige cellen. DNA-kloning gjør det mulig å studere denne operasjonen for forskjellige gener isolert.

Typiske applikasjoner for forskning og DNA-teknologi inkluderer å undersøke:

• Funksjonen til et gen.
• Mutasjoner av et gen.
• Genuttrykk.
• Genprodukter.
• Genetiske feil.

Når flere DNA-sekvenser blir klonet, er det lettere å finne og klone ytterligere sekvenser. De eksisterende klonede DNA-segmentene kan brukes til å bestemme om et nytt segment samsvarer med det gamle og hvilke deler som er forskjellige. Å identifisere en mål-DNA-sekvens er da raskere og mer nøyaktig.

I genterapi, presenteres et klonet gen for cellene i en organisme hvis naturlige gen er skadet. Et vitalt gen som produserer et protein som kreves for en bestemt organisme-funksjon, kan bli mutert, endret av stråling eller påvirket av virus.

Når genet ikke fungerer som det skal, mangler et viktig stoff i cellen. Genterapi prøver å erstatt genet med en klonet versjon som vil produsere det nødvendige stoffet.

Genterapi er fremdeles eksperimentell, og få pasienter har blitt kurert ved hjelp av teknikken. Problemene ligger i å identifisere det enkelte genet som er ansvarlig for en medisinsk tilstand og å levere mange kopier av genet til de riktige cellene. Siden DNA-kloning har blitt mer utbredt, har genterapi blitt brukt i flere spesifikke situasjoner.

Nylig vellykkede applikasjoner har inkludert:

• Parkinsons sykdom: Ved å bruke et virus som en vektor, ble et Parkinsons sykdomsrelatert gen injisert i pasientens mellomhjerne. Pasientene opplevde forbedret motorikk uten uønskede bivirkninger.
• Adenosindeaminase (ADA) -mangel: En genetisk immunforstyrrelse ble behandlet ved å fjerne pasienters blodstamceller og sette inn ADA-genet. Pasienter var i stand til å produsere i det minste noe av sin egen ADA som et resultat.
• Hemofili: Personer med hemofili produserer ikke spesifikke proteiner som hjelper blodpropp. Et gen for produksjon av et av de manglende proteinene ble satt inn i levercellene til pasientene. Pasienter produserte proteinet og blødningshendelser ble redusert.

Genterapi er en av de mest lovende anvendelsene av DNA-kloning, men andre nye bruksområder vil sannsynligvis spre seg ettersom flere DNA-sekvenser blir studert og deres funksjon bestemmes. DNA-kloning leverer råmaterialet til genteknikk i de nødvendige mengdene.

Når generens rolle er kjent og deres rette funksjon kan sikres ved erstatning av defekt gener, mange kroniske sykdommer og til og med kreft kan angripes og behandles på genetisk nivå ved hjelp av DNA teknologi.

Relatert innhold:

• Koloniegenskaper for E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Definisjon, funksjon, struktur