高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を使用する場合、信頼性の高い高品質の結果を保証するには、適切なキャリブレーションが絶対に不可欠です。 HPLC機器の適切なキャリブレーションは、適切なキャリブレーション標準を作成することから始まります。 ほとんどの場合、実際のキャリブレーションでは、検量線と呼ばれるものを作成するために、濃度を上げる一連の標準が必要です。 これは、テスト対象の化学物質の濃度とHPLC検出器の応答との関係を説明するプロットされた線と関連する方程式です。
HPLCを使用してテストする化学物質（「分析物」）を決定します。 たとえば、一連のソフトドリンクのフルクトース含有量をテストしたい場合があります。この場合、フルクトースが分析対象物になります。
適切な純度の分析対象化学物質を大量に入手します。 通常、純度は99％を超えている必要があり、分析対象物は信頼できる化学薬品供給会社から購入する必要があります。 たとえば、フルクトースの場合、食料品店からではなく、化学品のベンダーから純粋なフルクトースを購入します。
HPLCでテストする予定のサンプル中の分析対象物の予想される最大濃度と最小濃度を決定します。 ソフトドリンクの場合は、ドリンクのラベルを調べて、テストするドリンクの中でフルクトースの含有量が最も少ないものと最も高いものを判断します。 最初のサンプル（ソフトドリンク）は、分析の準備中に希釈または操作される可能性があることに注意してください （使用するHPLCメソッドによって異なります）したがって、実際にHPLCに注入されたサンプル中の分析対象物の濃度は次のようになります。 変更されました。 考慮しなければならないのは、HPLCで実行されたサンプル中の分析対象物の濃度です。
分析対象物を溶解してキャリブレーション標準を作成する溶媒を決定します。 この溶媒は、比較的広範囲の濃度（少なくともテストするサンプルと同じ高さ）で分析対象物を適切に溶解できなければなりません。 同様に、この溶媒は、理想的には「移動相」と非常によく似ている必要があります。これは、HPLC機器を介してサンプルを運ぶために使用される溶媒です。
分析物の「ストック標準」溶液を作成するために必要な分析物の量を計算します。 これは、ストック標準の必要な濃度に目的の容量を掛けることによって求められます。 この溶液中の分析対象物の濃度は、予想される最高のサンプル濃度よりも少なくとも10％高くする必要があります。 清涼飲料サンプルで予想される最高のフルクトース濃度が8グラム/ 100ミリリットルである場合、ストック標準は10グラムのフルクトース/ 100ミリリットルの濃度にすることができます。 妥当な容量は500ミリリットルであるため、8/100 mL x 500 mL = 40グラムのフルクトースが必要になります。
必要な量の分析物を適切なレベルの精度で計量します。 多くの場合、小数点以下1桁または2桁の精度のグラム単位の重量値が適切ですが、一部の方法ではより高い精度が必要になる場合があります。
計量した分析対象物を必要な容量のメスフラスコに移し、フラスコの充填マークに目的の溶媒を追加します。 （たとえば、目盛り付きビーカーではなく）メスフラスコを使用すると、ストック標準濃度値の精度が向上します。 すべての分析対象物がフラスコに移されていることを確認します。 必要に応じて、溶剤の一部を使用して洗い流します。
既知の量のストック標準をメスフラスコに移し、正確に移すためにピペットを使用してから溶媒を加えることにより、ストック標準の一連のさまざまな希釈を行います。 最低標準濃度は、分析する予想最低サンプルよりも低くする必要があります。 炭酸飲料の例では、サンプル中の予想される最低のフルクトース濃度が2グラム/ 100 mLの場合、1グラム/ 100mLの標準を作成できます。 これは、ストック標準の10倍希釈によって行われます。 標準シリーズには合計5または6の濃度が含まれている必要があるため、おそらく3、5、および8グラムのフルクトース/ mLの標準を生成するために追加の希釈が必要になります。 これで、HPLCを校正するための一連の標準溶液ができました。