Cuando se trabaja con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), una buena calibración es absolutamente esencial para garantizar resultados fiables y de calidad. La calibración adecuada de un instrumento de HPLC comienza con la elaboración de un estándar de calibración adecuado. En la mayoría de los casos, la calibración requiere de hecho una serie de estándares de concentración creciente para producir lo que se conoce como curva de calibración. Esta es una línea trazada y una ecuación asociada que describe la relación entre la concentración de la sustancia química que se está probando y la respuesta del detector de HPLC.
Determine la sustancia química que desea analizar mediante HPLC (el "analito"). Por ejemplo, es posible que desee probar una serie de refrescos para determinar el contenido de fructosa, en cuyo caso la fructosa sería el analito.
Obtenga una cantidad del analito químico de pureza adecuada. Normalmente, la pureza debe ser superior al 99% y el analito debe adquirirse en una empresa de suministro de productos químicos de buena reputación. En el caso de la fructosa, por ejemplo, compraría fructosa pura a un proveedor de productos químicos y no a una tienda de comestibles.
Determine las concentraciones anticipadas máxima y mínima del analito en las muestras que desea analizar en la HPLC. En el caso de los refrescos, debe examinar las etiquetas de las bebidas y determinar el contenido de fructosa más bajo y más alto entre las bebidas que probará. Tenga en cuenta que la muestra inicial (el refresco) puede diluirse o manipularse durante la preparación para el análisis. (dependiendo del método de HPLC que se utilice), por lo que la concentración de analito en las muestras realmente inyectadas en la HPLC puede ser modificado. Es la concentración de analito en las muestras que se procesan en el HPLC lo que debe tenerse en cuenta.
Determine el disolvente en el que disolverá su analito para preparar los estándares de calibración. Este disolvente debe poder disolver correctamente el analito en un rango de concentración relativamente amplio (al menos tan alto como en las muestras que desea analizar). Además, este disolvente idealmente debería ser bastante similar a la "fase móvil": el disolvente utilizado para transportar las muestras a través del instrumento de HPLC.
Calcule la cantidad de analito necesaria para preparar una solución "patrón de reserva" del analito. Esto se encuentra multiplicando la concentración requerida del estándar de reserva por el volumen deseado. La concentración del analito en esta solución debe ser al menos un 10% más alta que la concentración de muestra más alta prevista. Si la concentración de fructosa más alta esperada en una muestra de refresco es de 8 gramos / 100 mililitros, entonces el estándar de reserva se podría preparar a una concentración de 10 gramos de fructosa / 100 mililitros. Un volumen razonable es de 500 mililitros, por lo que se necesitarían 8/100 mL x 500 mL = 40 gramos de fructosa.
Pese la cantidad requerida de analito con un nivel adecuado de precisión. A menudo, es adecuado un valor de peso en gramos con una precisión de uno o dos lugares decimales, pero algunos métodos pueden necesitar más precisión.
Transferir el analito pesado a un matraz aforado del volumen necesario y agregar el disolvente deseado a la marca de llenado del matraz. El uso de un matraz aforado (en lugar de un vaso de precipitados graduado, por ejemplo) aumenta la precisión del valor de concentración estándar de stock. Asegúrese de que todo el analito se transfiera al matraz; use un poco de solvente para lavarlo, si es necesario.
Realice una serie de diluciones variables del estándar madre transfiriendo volúmenes conocidos del estándar madre a matraces volumétricos, utilizando pipetas para una transferencia precisa y luego agregando disolvente. La concentración estándar más baja debe estar por debajo de la muestra más baja anticipada para ser analizada. En el ejemplo del refresco, si la concentración de fructosa más baja esperada en una muestra es de 2 gramos / 100 ml, entonces se podría preparar un estándar de 1 gramo / 100 ml. Esto se haría diluyendo diez veces el estándar de stock. La serie estándar debe incluir un total de 5 o 6 concentraciones, por lo que se necesitarían diluciones adicionales para producir estándares de quizás 3, 5 y 8 gramos de fructosa / ml. Ahora tiene una serie de soluciones estándar con las que calibrar la HPLC.