La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica de laboratorio que se utiliza para separar e identificar compuestos. Es un tipo de cromatografía en columna que se basa en diferentes polaridades de compuestos en una solución para separarlos. La HPLC se diferencia de la cromatografía en columna estándar porque utiliza presión para forzar la solución a través de la columna más rápidamente y, por lo tanto, produce resultados más rápidos y, a veces, más precisos. El objetivo es separar los compuestos en la columna y hacer que salgan por separado.
Debido a la velocidad de HPLC y su dependencia de diferentes polaridades de compuestos, dos compuestos con estructura y polaridades similares pueden salir del aparato de cromatografía al mismo tiempo o casi al mismo tiempo hora. Esto se conoce como coelución. La coelución dificulta la determinación exacta de qué porción de la mezcla eluyó en qué punto.
Por lo general, la HPLC utiliza una columna de vidrio llena de perlas hechas de diferentes materiales. Las mezclas que se fuerzan a través de la columna tienen sustancias químicas que se unen con diferentes fuerzas a las perlas. La fuerza de la unión, que depende de la similitud en la polaridad, determina cuánto tiempo se unirá la sustancia química a la perla antes de ser liberada. Algunos compuestos se unen con tanta fuerza que esencialmente nunca se liberan de las perlas de la columna y nunca se miden en la solución que sale de la columna.
Las técnicas típicas de separación de laboratorio implican desarrollar un ensayo o método de separación y luego implementar ese ensayo para separar compuestos individuales de una solución. Sin embargo, esto generalmente da como resultado múltiples soluciones que también deben someterse a procedimientos, lo que lleva a un aumento exponencial de la complejidad. Aunque la HPLC a menudo puede simplificar y acelerar este proceso, el costo de desarrollar un aparato de HPLC puede llegar a ser tremendo. Desarrollar un aparato de HPLC, aunque mucho más eficiente, es mucho más costoso que desarrollar otros ensayos para separar compuestos. Esto hace que no sea económicamente viable para muchos laboratorios pequeños de propiedad privada.
La HPLC no solo se usa para separar compuestos simples, también se usa para aislar proteínas específicas de una mezcla celular. En este caso, las perlas de la columna suelen estar recubiertas con un anticuerpo específico para la proteína que necesita recolectar. Las proteínas se unen a los anticuerpos y la solución restante se pasa a través de la columna, luego las proteínas se liberan usando otra solución y se recolectan. Esto requiere un técnico altamente calificado para monitorear la columna en todo momento y asegurarse de que el proceso se esté ejecutando exactamente como se planeó.