Πηγή περιοριστικών ενζύμων

Από την ανακάλυψη των περιοριστικών ενζύμων, το πεδίο της μοριακής βιολογίας έχει προχωρήσει ταχύτατα λόγω της μοναδικής ικανότητας αυτών των πρωτεϊνών να διασπά το DNA με συγκεκριμένο τρόπο. Αυτά τα απλά ένζυμα είχαν βαθιά επίδραση στην έρευνα σε όλο τον κόσμο. παραδόξως, έχουμε βακτήρια για να ευχαριστήσουμε για αυτό το επιστημονικό δώρο.

Τα ένζυμα περιορισμού, που ονομάζονται επίσης ενδονουκλεάσες περιορισμού, συνδέονται με το DNA και διασπώνται το διπλό κλώνο, σχηματίζοντας μικρότερα κομμάτια DNA. Υπάρχουν τρεις τύποι περιοριστικών ενζύμων. Τα ένζυμα περιορισμού τύπου Ι αναγνωρίζουν μια αλληλουχία DNA και κόβουν τον κλώνο τυχαία περισσότερα από χίλια ζεύγη βάσεων μακριά από την τοποθεσία. Τα ένζυμα περιορισμού τύπου II, τα πιο χρήσιμα για εργαστήρια μοριακής βιολογίας, αναγνωρίζουν και κόβουν τον κλώνο του DNA προβλέψιμα σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία η οποία συνήθως έχει μήκος μικρότερο από δέκα ζεύγη βάσεων. Τα ένζυμα περιορισμού τύπου III είναι παρόμοια με τον τύπο Ι, αλλά αυτά κόβουν το DNA περίπου τριάντα ζεύγη βάσεων από την αλληλουχία αναγνώρισης.

Τα βακτηριακά είδη είναι η κύρια πηγή εμπορικών ενζύμων περιορισμού. Αυτά τα ένζυμα χρησιμεύουν για την υπεράσπιση των βακτηριακών κυττάρων από εισβολή από ξένο DNA, όπως αλληλουχίες νουκλεϊκών οξέων που χρησιμοποιούνται από ιούς για να αναπαράγονται μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή. Βασικά, το ένζυμο θα τεμαχίσει το DNA σε πολύ μικρότερα τεμάχια που θέτουν λίγο κίνδυνο για το κύτταρο. Τα ένζυμα ονομάζονται για το είδος και το στέλεχος των βακτηρίων που το παράγουν. Για παράδειγμα, το πρώτο ένζυμο περιορισμού που εξάγεται από το στέλεχος RY13 Escherichia coli ονομάζεται EcoRI και το πέμπτο ένζυμο που εξάγεται από το ίδιο είδος ονομάζεται EcoRV.

Η χρήση περιοριστικών ενζύμων τύπου II είναι σχεδόν καθολική σε εργαστήρια σε ολόκληρο τον κόσμο. Τα μόρια του DNA είναι εξαιρετικά μακρά και δύσκολο να διαχειριστούν σωστά, ειδικά εάν ένας ερευνητής ενδιαφέρεται μόνο για ένα ή δύο γονίδια. Τα ένζυμα περιορισμού επιτρέπουν στον επιστήμονα να κόψει αξιόπιστα το DNA σε πολύ μικρότερα τμήματα. Αυτή η ικανότητα χειρισμού του DNA επέτρεψε την πρόοδο της χαρτογράφησης περιορισμού και της μοριακής κλωνοποίησης.

Σε εργαστηριακό περιβάλλον, το να γνωρίζεις ακριβώς πού βρίσκονται ορισμένες θέσεις περιορισμού σε ένα σκέλος DNA είναι εξαιρετικά χρήσιμη και βολική. Εάν είναι γνωστή η αλληλουχία DNA, η χαρτογράφηση περιορισμού μπορεί να γίνει από υπολογιστή, ο οποίος μπορεί να χαρτογραφήσει γρήγορα όλες τις πιθανές αλληλουχίες αναγνώρισης περιοριστικών ενζύμων. Εάν η αλληλουχία DNA δεν είναι γνωστή, ένας ερευνητής μπορεί ακόμα να δημιουργήσει έναν γενικό χάρτη χρησιμοποιώντας διαφορετικά ένζυμα από μόνα τους και σε συνδυασμό με άλλα ένζυμα για τη διάσπαση του μορίου. Χρησιμοποιώντας την αφαιρετική συλλογιστική, μπορεί να δημιουργηθεί ο γενικός χάρτης περιορισμού. Η διαθεσιμότητα ενός χάρτη περιορισμού είναι κρίσιμη κατά την κλωνοποίηση γονιδίων.

Η μοριακή κλωνοποίηση είναι μια εργαστηριακή τεχνική στην οποία ένα γονίδιο κόβεται από ένα μόριο DNA στόχου, συνήθως εκχυλίζεται από έναν οργανισμό, με περιοριστικά ένζυμα. Στη συνέχεια, το γονίδιο εισάγεται σε ένα μόριο που ονομάζεται φορέας, που είναι συνήθως μικρά κομμάτια κυκλικό DNA που ονομάζεται πλασμίδια τα οποία έχουν τροποποιηθεί ώστε να φέρουν αρκετούς στόχους ενζύμου περιορισμού ακολουθίες. Ο φορέας διασπάται ανοιχτός με περιοριστικά ένζυμα, και στη συνέχεια το γονίδιο εισάγεται στο κυκλικό DNA. Ένα ένζυμο που ονομάζεται DNA λιγάση μπορεί στη συνέχεια να αναμορφώσει τον κύκλο ώστε να συμπεριλάβει το γονίδιο στόχο. Μόλις το γονίδιο «κλωνοποιηθεί» με τέτοιο τρόπο, ο φορέας μπορεί να εισαχθεί σε ένα βακτηριακό κύτταρο έτσι ώστε το γονίδιο να παράγει πρωτεΐνη.