Πώς δημιουργείται το ανασυνδυασμένο DNA;

Το ανασυνδυασμένο DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) είναι ένας συνθετικός τύπος νουκλεϊκού οξέος που δημιουργείται με σύνδεση DNA αλληλουχίες μαζί που δεν θα υπήρχαν φυσικά υπό κανονικές συνθήκες και περιβαλλοντικές συνθήκες.

Η διαδικασία δημιουργίας ανασυνδυασμένου DNA συνήθως γίνεται με ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Συγκεκριμένα, κατασκευάζεται από μια προηγμένη διαδικασία τεχνολογίας DNA στη βιολογία και τη γενετική που είναι γνωστή ως κλωνοποίηση γονιδίων. Το ανασυνδυασμένο DNA τοποθετείται σε ένα κύτταρο, το οποίο στη συνέχεια παράγει μια εντελώς νέα πρωτεΐνη και χρησιμοποιείται για τη σύνθεση φαρμάκων, αντισωμάτων ή συγκεκριμένων πρωτεϊνών μόνο για έρευνα.

Το DNA από οργανισμό δότη ή βιολογική πηγή εξάγεται πρώτα από κύτταρα και μετά υποβάλλεται σε διαδικασία κοπής γνωστή ως ενζυματικός περιορισμός. Αυτό δημιουργεί θραύσματα DNA που περιέχουν το γονίδιο ή γονίδια ενδιαφέροντος. Αυτά τα θραύσματα μπορούν στη συνέχεια να "κλωνοποιηθούν" (δηλαδή να εισαχθούν) ή να κολληθούν σε θραύσματα από τον οργανισμό-δέκτη.

Στη συνέχεια εισάγονται σε μεγαλύτερα μόρια DNA (ένα «ανασυνδυασμένο πλασμίδιο»), τα οποία τοποθετούνται σε ένα βακτήριο και αφήνονται να πολλαπλασιαστούν. Το ανασυνδυασμένο DNA ανακτάται και επαληθεύεται.

Διαβάστε περισσότερα σχετικά με τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της τεχνολογίας ανασυνδυασμένου DNA.

Το DNA πρέπει πρώτα να εκχυλιστεί και να καθαριστεί από άλλα κυτταρικά μόρια, όπως ριβονουκλεϊκά οξέα (RNAs), πρωτεΐνες και δομές όπως κυτταρικές μεμβράνες. Για κλωνοποίηση, το DNA λαμβάνεται από τον πυρήνα και είναι γνωστό ως "γονιδιωματικό DNA". Μια κοινή μέθοδος για το DNA η εκχύλιση γίνεται με υπερφυγοκέντρηση συστατικών κυττάρων σε βαθμίδα πυκνότητας που αποτελείται από βρωμιούχο αιθίδιο σε καίσιο χλωριούχο.

Εναλλακτικά, μια σειρά αλκαλικών πλύσεων και ρυθμιστικών αλάτων μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ανάκτηση του DNA. Μόλις καταβυθιστεί και καθαριστεί από όλους τους άλλους ανεπιθύμητους ρύπους, το DNA μπορεί να κοπεί σε θραύσματα.

Τα ένζυμα περιορισμού είναι ένζυμα που κόβουν πολύ συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA. χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία μοναδικών θραυσμάτων DNA. Αυτή η διαδικασία διασφαλίζει ότι δεν δημιουργούνται και δεν γίνονται ανακριβείς, λανθασμένες ή ανεπιθύμητες αλληλουχίες κατά λάθος ενσωματώθηκε στο τελικό ανασυνδυασμένο DNA, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε πειραματική αποτυχία και κυτταρικός θάνατος.

Για τη δημιουργία των επιθυμητών θραυσμάτων ϋΝΑ, ένα συγκεκριμένο απλό (ή συνδυασμό) ενζύμων (ών) χρησιμοποιείται για τη διάσπαση ή την πέψη του DNA. Τα θραύσματα στη συνέχεια καθαρίζονται με ηλεκτροφόρηση γέλης, η οποία τα διαχωρίζει από το ανεπιθύμητο DNA. Μια μέθοδος τεχνολογίας DNA cruder περιλαμβάνει απλώς μηχανική διάτμηση, η οποία σκίζει τα μακρύτερα τμήματα DNA σε μικρότερα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για κλωνοποίηση.

Η απολίνωση είναι η διαδικασία συγκόλλησης ή σύνδεσης των θραυσμάτων DNA δότη και λήπτη (ή φορέα) για τη δημιουργία ανασυνδυασμένου μορίου DNA πλασμιδίου. Στην ιδανική περίπτωση, τα ένζυμα περιορισμού που επιλέχθηκαν για τη δημιουργία των θραυσμάτων θα ήταν πολύ προσεκτικά μελετημένα και σχεδιασμένα έτσι ώστε να επιτρέπουν σε αυτά τα κομμάτια να ενώνονται σαν ένα παζλ.

Για να γίνει αυτό, προτιμώνται τα ένζυμα περιορισμού που παράγουν συμβατά "κολλώδη άκρα", έτσι ώστε όλα τα συμβατά θραύσματα να ενώνουν φυσικά μεταξύ τους. Διαφορετικά, το ένζυμο λιγάσης DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να ενώσει τα τμήματα DNA με δεσμούς φωσφοδιεστέρα.

Η διαδικασία μετασχηματισμού ή θερμικού σοκ χρησιμοποιείται για την τοποθέτηση του μορίου ανασυνδυασμένου DNA σε ένα βακτηριακό κύτταρο ξενιστή, το οποίο μπορεί στη συνέχεια να δημιουργήσει πολλά αντίγραφα του συνθετικού DNA. Αυτά τα βακτήρια καλλιεργούνται σε πλάκες άγαρ, καλλιεργούνται σε ειδικούς βακτηριακούς ζωμούς και μετά λύονται με σκοπό την απελευθέρωση του ανασυνδυασμένου DNA. Τέλος, το DNA μπορεί να επαληθευτεί με προσδιορισμό αλληλουχίας DNA, λειτουργικά πειράματα και πέψη ενζύμων περιορισμού.

Η τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιείται για τα πάντα, από ακαδημαϊκά εργαστηριακά πειράματα έως τη δημιουργία φαρμακευτικών φαρμάκων. Είναι επίσης ένα σημαντικό μέρος της αλληλουχίας DNA και της ταυτοποίησης γονιδίων.

Μπορείτε να διαβάσετε περισσότερες άφθονες χρήσεις για αυτό Τεχνολογία DNA εδώ.

Διαβάστε περισσότερα σχετικά με τη διαφορά μεταξύ ανασυνδυασμένου DNA και γενετικής μηχανικής.