พิมพ์เขียวทางพันธุกรรมของเซลล์ถูกเข้ารหัสภายในสารพันธุกรรมหรือดีเอ็นเอ เนื่องจาก DNA ไม่เคยออกจากนิวเคลียสของเซลล์เพื่อให้ข้อมูลนี้เข้าสู่ไซโตพลาสซึมที่อื่น โปรตีนและส่วนประกอบทางชีวเคมีอาศัยอยู่ จำเป็นต้องถอดรหัส DNA เป็น messenger RNA (mRNA หรือ poly (ก) อาร์เอ็นเอ). จากนั้น mRNA นี้จะถูกแปลเป็นโปรตีนที่ทำหน้าที่หลายอย่างของเซลล์ ในการตรวจจับหรือหาปริมาณ mRNA ที่หายากมาก สร้างโพรบสำหรับไมโครอาร์เรย์หรือสร้างไลบรารีของโมเลกุล DNA เสริม mRNA จะต้องถูกแยกออก อย่างไรก็ตาม การแยก RNA ทั้งหมด (เช่น RNA ทั้งหมดในเซลล์) และการแยก mRNA ที่ตามมานั้นไม่ใช่กระบวนการที่แยกจากกัน จะต้องดำเนินการแบบเดิมเพื่อแยก mRNA ออก
การทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน TRIzol: RNA ทั้งหมดรวมถึง mRNA ทั้งหมด, RNA การถ่ายโอน, ribosomal RNA และ noncoding อื่น ๆ RNA เพื่อแยกสิ่งเหล่านี้ออกจากส่วนประกอบของเซลล์อื่น ๆ เซลล์จะถูกเปิดออกก่อนเพื่อปลดปล่อย เนื้อหา ทำได้โดยการแขวนเซลล์ที่ถูกอัดเป็นเม็ดใหม่โดยการหมุนเหวี่ยง (หมุนด้วยความเร็วสูง) ใน TRIzol Reagent (Life Technologies) TRIzol เวอร์ชันอื่นๆ (เช่น TRI Reagent ของ Ambion) ทำงานในลักษณะเดียวกัน
การแยก RNA ทั้งหมด: ชุดของการหมุนเหวี่ยงใช้เพื่อแยกส่วนประกอบต่างๆ (โปรตีน, DNA, RNA) ของเซลล์ออกเป็นชั้นหรือเฟสภายในสารแขวนลอย เฟสสีเหลืองด้านบนประกอบด้วยไขมันและสามารถทิ้งได้ ระยะที่ต้องการจะเป็นสีแดง ประกอบด้วย RNA ทั้งหมดและคงไว้ หลังจากทำการสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์มและล้างแอลกอฮอล์หลายชุดโดยใช้ไอโซโพรพานอลและเอทานอล RNA จะถูกอัดเป็นเม็ดเพื่อแยก mRNA เพิ่มสารยับยั้ง RNase เพื่อป้องกันไม่ให้เอนไซม์นี้ย่อยสลาย RNA ทั้งหมด
การแยก mRNA: เป็นเรื่องปกติที่จะใช้ชุดเครื่องมือเพื่อแยก mRNA เนื่องจากโปรโตคอลในห้องปฏิบัติการทำเองไม่ได้สร้างปริมาณมาก ของ mRNA ที่มีความบริสุทธิ์สูง ชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ประกอบด้วย FastTrack 2.0 ของ Invitrogen หรือการแยก mRNA บริสุทธิ์ของ Poly (A) ของ Ambion ชุด. ขั้นตอนพื้นฐานเหล่านี้เป็นเรื่องปกติสำหรับชุดอุปกรณ์ดังกล่าว:
d) ปั่นแยกตัวอย่างนี้และนำส่วนลอยเหนือตะกอนกลับคืนมา ซึ่งถูกล้างหลายครั้งในชุดของสารยึดเกาะและบัฟเฟอร์เกลือต่ำที่มีให้ในชุดอุปกรณ์
อ้างอิง
- "โปรโตคอลห้องสมุด cDNA"; เอียน จี. โคเวลและแคโรไลน์ เอ. ออสติน; 1997
- "โปรโตคอลการถอดเสียงและการแปลในหลอดทดลอง"; มาร์ติน เจ. ทิมส์; 1995
เคล็ดลับ
- เก็บรีเอเจนต์ เซลล์ และ RNA ทั้งหมดให้เย็นโดยการแช่ในน้ำแข็ง ซึ่งจะป้องกันไม่ให้ RNA ถูกทำลายโดยเอ็นไซม์อื่นๆ ที่ปล่อยออกมาในระหว่างกระบวนการทำให้เป็นเนื้อเดียวกัน
คำเตือน
- รีเอเจนต์เช่น TRIzol เป็นพิษและต้องไม่สัมผัสกับผิวหนังหรือเยื่อเมือก สังเกตโปรโตคอลห้องปฏิบัติการที่ปลอดภัยเสมอเมื่อจัดการรีเอเจนต์นี้
เกี่ยวกับผู้เขียน
Palmer Owyoung สำเร็จการศึกษาศิลปศาสตรมหาบัณฑิตสาขาธุรกิจระหว่างประเทศจาก University of California at San Diego และ a ศิลปศาสตรบัณฑิตสาขาสังคมวิทยาจากมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนียที่ซานตาบาร์บาร่าและเป็นโมเลกุลที่ได้รับการฝึกอบรม นักชีววิทยา เขาเป็นนักเขียนอิสระมาตั้งแต่ปี 2549 นอกเหนือจากการเขียนแล้ว เขายังเป็นนักเทรด Forex เต็มเวลาและนักการตลาดทางอินเทอร์เน็ต
เครดิตภาพ
Jupiterimages/Photos.com/Getty Images