เมื่อทำงานกับโครมาโตกราฟีของเหลวที่มีประสิทธิภาพสูง (HPLC) การสอบเทียบที่ดีเป็นสิ่งสำคัญอย่างยิ่งเพื่อให้แน่ใจว่าได้ผลลัพธ์ที่มีคุณภาพและเชื่อถือได้ การสอบเทียบเครื่องมือ HPLC อย่างเหมาะสมเริ่มต้นด้วยการสร้างมาตรฐานการสอบเทียบที่เหมาะสม ในกรณีส่วนใหญ่ ที่จริงแล้ว การสอบเทียบต้องการชุดมาตรฐานของความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้น เพื่อสร้างสิ่งที่เรียกว่าเส้นโค้งการสอบเทียบ นี่คือเส้นพล็อตและสมการที่เกี่ยวข้องซึ่งอธิบายความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของสารเคมีที่กำลังทดสอบและการตอบสนองของตัวตรวจวัด HPLC
กำหนดสารเคมีที่คุณต้องการทดสอบโดยใช้ HPLC ("สารวิเคราะห์") ตัวอย่างเช่น คุณอาจต้องการทดสอบชุดน้ำอัดลมเพื่อหาปริมาณฟรุกโตส ซึ่งในกรณีนี้ ฟรุกโตสจะเป็นตัววิเคราะห์
หาปริมาณของสารเคมีที่วิเคราะห์ซึ่งมีความบริสุทธิ์ที่เหมาะสม โดยปกติความบริสุทธิ์ควรสูงกว่า 99% และควรซื้อสารวิเคราะห์จากบริษัทจัดหาสารเคมีที่มีชื่อเสียง ตัวอย่างเช่น ในกรณีของฟรุกโตส คุณจะซื้อฟรุกโตสบริสุทธิ์จากผู้จำหน่ายสารเคมี ไม่ใช่จากร้านขายของชำ
กำหนดความเข้มข้นสูงสุดและต่ำสุดที่คาดการณ์ไว้ของสารที่วิเคราะห์ในตัวอย่างที่คุณต้องการทดสอบบน HPLC ในกรณีของเครื่องดื่มประเภทน้ำอัดลม คุณจะต้องตรวจสอบฉลากของเครื่องดื่มและกำหนดปริมาณฟรุกโตสที่ต่ำที่สุดและสูงสุดในบรรดาเครื่องดื่มที่คุณจะทดสอบ โปรดทราบว่าตัวอย่างแรกเริ่ม (น้ำอัดลม) อาจถูกทำให้เจือจางหรือถูกปรับแต่งในระหว่างการเตรียมการวิเคราะห์ (ขึ้นอยู่กับวิธี HPLC ที่ใช้) ดังนั้นความเข้มข้นของสารที่วิเคราะห์ในตัวอย่างที่ฉีดเข้าสู่ HPLC จริงอาจเป็น แก้ไข เป็นความเข้มข้นของสารวิเคราะห์ในตัวอย่างที่รันบน HPLC ที่ต้องพิจารณา
กำหนดตัวทำละลายที่คุณจะละลายสารที่วิเคราะห์เพื่อสร้างมาตรฐานการสอบเทียบ ตัวทำละลายนี้ต้องสามารถละลายสารที่วิเคราะห์ได้อย่างเหมาะสมในช่วงความเข้มข้นที่ค่อนข้างกว้าง (อย่างน้อยก็สูงเท่ากับในตัวอย่างที่คุณต้องการทดสอบ) เช่นกัน ตัวทำละลายนี้ตามอุดมคติแล้วควรจะค่อนข้างคล้ายกับ "เฟสเคลื่อนที่": ตัวทำละลายที่ใช้ในการส่งตัวอย่างผ่านเครื่องมือ HPLC
คำนวณปริมาณของตัววิเคราะห์ที่จำเป็นในการสร้างโซลูชัน "มาตรฐานสต็อก" ของตัววิเคราะห์ พบได้จากการคูณความเข้มข้นที่ต้องการของมาตรฐานสต็อกด้วยปริมาตรที่ต้องการ ความเข้มข้นของสารที่วิเคราะห์ในสารละลายนี้ควรสูงกว่าความเข้มข้นของตัวอย่างสูงสุดที่คาดการณ์ไว้อย่างน้อย 10% หากความเข้มข้นของฟรุกโตสที่คาดการณ์ไว้สูงสุดในตัวอย่างน้ำอัดลมคือ 8 กรัม/100 มิลลิลิตร มาตรฐานสต็อกก็สามารถทำได้ที่ความเข้มข้น 10 กรัมของฟรุกโตส/100 มิลลิลิตร ปริมาตรที่เหมาะสมคือ 500 มิลลิลิตร ดังนั้นต้องใช้ฟรุกโตส 8/100 มล. x 500 มล. = 40 กรัม
ชั่งน้ำหนักปริมาณของสารที่วิเคราะห์ที่ต้องการให้ได้ระดับความแม่นยำที่เหมาะสม บ่อยครั้งที่ค่าน้ำหนักเป็นกรัมที่แม่นยำถึงทศนิยมหนึ่งหรือสองตำแหน่งนั้นเหมาะสม แต่วิธีการบางอย่างอาจต้องมีความแม่นยำมากกว่านี้
ถ่ายสารที่วิเคราะห์ที่ชั่งน้ำหนักแล้วไปยังขวดปริมาตรของปริมาตรที่จำเป็น และเพิ่มตัวทำละลายที่ต้องการไปยังเครื่องหมายเติมบนขวด การใช้ขวดปริมาตร (แทนที่จะใช้บีกเกอร์แบบไล่ระดับ เป็นต้น) จะเพิ่มความแม่นยำของค่าความเข้มข้นมาตรฐานของสต็อค ตรวจสอบให้แน่ใจว่าสารที่วิเคราะห์ทั้งหมดถูกถ่ายโอนไปยังขวด ใช้ตัวทำละลายบางส่วนในการล้างหากจำเป็น
สร้างชุดการเจือจางต่างๆ ของมาตรฐานสต็อกโดยการถ่ายโอนปริมาตรที่ทราบของมาตรฐานสต็อกลงในขวดปริมาตร โดยใช้ปิเปตเพื่อการถ่ายโอนที่ถูกต้อง จากนั้นจึงเติมตัวทำละลาย ความเข้มข้นมาตรฐานต่ำสุดควรต่ำกว่าตัวอย่างที่คาดไว้ต่ำสุดที่จะวิเคราะห์ ในตัวอย่างน้ำอัดลม หากความเข้มข้นของฟรุกโตสต่ำสุดที่คาดไว้ในตัวอย่างคือ 2 กรัม/100 มล. ก็สามารถสร้างมาตรฐาน 1 กรัม/100 มล. สิ่งนี้จะทำโดยการเจือจางมาตรฐานสต็อกเป็นสิบเท่า ชุดมาตรฐานควรมีความเข้มข้นทั้งหมด 5 หรือ 6 รายการ ดังนั้นจำเป็นต้องมีการเจือจางเพิ่มเติมเพื่อผลิตมาตรฐานฟรุกโตส 3, 5 และ 8 กรัม/มล. ตอนนี้คุณมีชุดโซลูชันมาตรฐานสำหรับสอบเทียบ HPLC