Verižna reakcija s polimerazo ali PCR je tehnika, ki en fragment DNA fotokopira v številne fragmente - eksponentno veliko. Prvi korak je v PCR, da se DNA segreje tako, da se denaturira ali stopi v posamezne verige. Struktura DNK je podobna vrvni lestvi, v kateri so prečke vrvi z magnetnimi konci. Magneti se povezujejo in tvorijo stopnice, imenovane osnovni pari, in se tako upirajo ločitvi. Vsak fragment DNA se topi v posamezne verige pri različnih temperaturah. Razumevanje, kako posamezne dele DNA držijo strukturo DNK, bo dalo vpogled v to, zakaj različni fragmenti DNA se topijo pri različnih temperaturah in zakaj so najprej potrebne tako visoke temperature kraj.
Taljenje! Taljenje!
Prvi korak PCR je taljenje DNA, tako da se dvoverižna DNA loči v enoverižno DNA. Za DNA sesalcev ta prvi korak običajno vključuje toploto približno 95 stopinj Celzija (približno 200 Fahrenheitov). Pri tej temperaturi se vodikove vezi med osnovnima paroma A-T in G-C ali stopnicami v lestvi DNA pretrgajo in razvezajo dvoverižno DNA. Vendar temperatura ni dovolj vroča, da bi razbila fosfatno-sladkorno hrbtenico, ki tvori posamezne pramene ali drogove lestve. Popolna ločitev posameznih verig jih pripravi na drugi korak PCR, ki se hladi, da omogoči kratke fragmente DNA, imenovane začetnice, da vežejo posamezne verige.
Magnetne zadrge
Eden od razlogov, da se DNA segreje na visoko temperaturo 95 stopinj Celzija, je ta, da dlje ko je dvojna veriga DNA, bolj želi ostati skupaj. Dolžina DNA je eden od dejavnikov, ki vpliva na tališče, izbrano za PCR na tem kosu DNA. Osnovna para A-T in G-C v dvoverižni vezi DNA med seboj držita dvoverižno strukturo skupaj. Več zaporednih osnovnih parov med dvema enojnima pramenoma se veča, bolj se želijo povezati tudi njihovi sosedje in močnejša privlačnost med obema pramenoma postane. Je kot zadrga iz majhnih magnetov. Ko zaprete zadrgo, se bodo magneti seveda želeli zadrgniti in ostati zadrgo.
Močnejši magneti se držijo tesneje
Drug dejavnik, ki vpliva na to, katero temperaturo taljenja izbrati za vaš fragment DNA, ki vas zanima, je količina G-C baznih parov, prisotnih v tem fragmentu. Vsak osnovni par je kot dva mini magneta, ki privlačita. Par iz G in C je veliko močneje privlačen kot par A in T. Tako bo del DNA, ki ima več parov G-C kot drug fragment, zahteval višjo temperaturo, preden se bo stopil v posamezne verige. DNA naravno absorbira ultravijolično svetlobo - natančneje pri valovni dolžini 260 nanometrov - in enojna DNA absorbira več svetlobe kot dvoverižna DNA. Tako je merjenje količine absorbirane svetlobe način merjenja, koliko se je vaša dvoverižna DNA stopila v posamezne verige. Učinek "magnetne zadrge" baznih parov G-C in A-T povzroča graf absorpcije svetlobe dvoverižna DNA narisana proti zvišanju temperature, da je sigmoidna, v obliki črke S in ne a ravna črta. Krivulja S predstavlja upor timskega dela, ki ga osnovni pari izvajajo proti vročini, ker se nočejo ločiti.
Točka na pol poti
Temperatura, pri kateri se dolžina DNA stopi v posamezne verige, se imenuje njena temperatura taljenja, ki je označena s kratico "Tm". To kaže na temperaturo, pri kateri se je polovica DNA v raztopini stopila v enojne verige, druga polovica pa je še vedno v dvoverižni oblika. Temperatura taljenja je za vsak fragment DNA različna. DNA sesalcev ima vsebnost G-C 40%, kar pomeni, da je preostalih 60% baznih parov As in Ts. Njegova 40-odstotna vsebnost G-C povzroči, da se DNA sesalcev stopi pri 87 stopinjah Celzija (približno 189 Fahrenheitov). Zato je prvi korak PCR na DNA sesalcev segrevanje na 94 stopinj Celzija (201 Fahrenheit). Samo sedem stopinj vroče od temperature taljenja in vsi dvojni prameni se bodo popolnoma stopili v enojne pramene.
