O caldo nutritivo líquido é usado para cultivar bactérias como a Escherichia coli. As receitas para este caldo variam dependendo da espécie bacteriana e da presença de modificações genéticas, por exemplo, resistência a antibióticos. O caldo pode ser solidificado pela adição de ágar, o que permite que as bactérias formem colônias distintas, enquanto na cultura líquida elas simplesmente se dispersam por todo o volume. Esta é uma técnica básica, mas essencial para métodos avançados, como clonagem de genes ou ensaios microbiológicos. Este artigo assume que as cepas de laboratório padrão de Escherichia coli devem ser cultivadas em placas de ágar de caldo Luria (LB) (ou placas de petri).
Pesar 10 gramas de triptona de grau bacteriano, 5 gramas de extrato de levedura, 5 gramas de cloreto de sódio, 15 gramas de ágar ou agarose e 1 mililitro de hidróxido de sódio 1N. Misture com um volume de água destilada e esterilizada autoclavada até obter 1 litro de meio. Autoclave a mídia em frascos ou frascos com tampa frouxa por 25 minutos. Deixe esfriar até aproximadamente 50 graus Celsius antes de adicionar reagentes que serão destruídos em alta temperatura, como antibióticos ou outros suplementos nutricionais.
Deixe a mídia autoclavada esfriar até 50 graus Celsius e não abaixo de 45 graus Celsius, pois o ágar ficará assentado em seu recipiente antes de poder ser derramado. Obtenha placas de Petri estéreis e despeje o suficiente para cobrir toda a superfície da placa e pelo menos metade de sua profundidade. Evite encher demais as placas e, de preferência, não deixe que o ágar entre em contato com a borda superior da placa. Permita que as placas se solidifiquem em um ambiente estéril (por exemplo, sob uma capa de fluxo laminar), deixando as tampas fora e em um canto da capa.
Seque os pratos. Embora as placas possam ser usadas assim que estiverem firmes, alguma umidade estará presente na superfície do ágar, o que impedirá que as colônias de bactérias adiram suficientemente. Portanto, é melhor secar as placas antes de aplicar qualquer bactéria, por exemplo, deixando-as sentadas em temperatura ambiente por alguns dias ou por meia hora sob uma capela de fluxo laminar ou a 37 graus Celsius incubadora.
Guarde os pratos. As placas secas devem ser empilhadas de cabeça para baixo (invertidas) em suas tampas e devolvidas ao seu original embalagem, fechada com fita adesiva e embrulhada em papel alumínio para proteger da luz ou em um apropriado recipiente. Sempre escreva a data de preparo nas placas e evite usar se as placas tiverem mais de 2 meses.
Referências
- "Protocolos atuais em biologia molecular"; Karen Elbing e Roger Brent; 2002
Pontas
- Realize tantas das etapas acima (de preferência todas) quanto possível dentro de um ambiente estéril (por exemplo, sob um chama aberta ou uma capa de fluxo laminar) para impedir que contaminantes bacterianos transportados pelo ar entrem e cresçam no meios de comunicação.
Sobre o autor
Palmer Owyoung tem mestrado em negócios internacionais pela Universidade da Califórnia em San Diego e um Bacharel em Sociologia pela Universidade da Califórnia em Santa Bárbara e é um molecular formado biólogo. Ele é escritor freelance desde 2006. Além de escrever, ele é um comerciante de Forex em tempo integral e comerciante da Internet.
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