Sequenciamento de DNA: Definição, Métodos, Exemplos

Os nucleotídeos são os blocos de construção químicos da vida e são encontrados no DNA de organismos vivos. Cada nucleotídeo consiste em um açúcar, fosfato e um base contendo nitrogênio: adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G). A ordem específica dessas bases de nucleotídeos determina quais proteínas, enzimas e moléculas serão sintetizadas pela célula.

Determinar a ordem, ou a sequência de nucleotídeos, é importante para o estudo de mutações, evolução, progressão da doença, testes genéticos, investigação forense e medicina.

Genômica é o estudo do DNA, genes, interações gênicas e influências ambientais nos genes. O segredo para desvendar o complexo funcionamento interno dos genes é ser capaz de identificar sua estrutura e localização nos cromossomos.

O projeto dos organismos vivos é determinado pela ordem (ou sequência) dos pares de bases do ácido nucléico no DNA. Quando o DNA se replica, a adenina emparelha-se com a timina e a citosina com a guanina; pares incompatíveis são considerados mutações.

Desde a dupla hélice ácido desoxirribonucleico (DNA) molécula foi conceituada em 1953, melhorias dramáticas foram feitas no campo da genômica e sequenciamento de DNA em grande escala. Os cientistas estão trabalhando diligentemente para aplicar esse novo conhecimento ao tratamento individualizado de doenças.

Ao mesmo tempo, as discussões em andamento permitem que os pesquisadores fiquem à frente das implicações éticas dessas tecnologias em rápida explosão.

Seqüenciamento de DNA é o processo de descobrir a sequência de várias bases de nucleotídeos em fragmentos de DNA. O sequenciamento de genes inteiros permite comparações de cromossomos e genomas presentes na mesma espécie e em espécies diferentes.

Mapear cromossomos é útil para pesquisas científicas. Analisando os mecanismos e estrutura de genes, alelos e mutações cromossômicas em moléculas de DNA sugerem novas maneiras de tratar distúrbios genéticos e interromper o crescimento de tumor cancerígeno, por exemplo.

Métodos de sequenciamento de DNA de Frederick Sanger avançou muito no campo da genômica a partir da década de 1970. Sanger se sentiu pronto para lidar com o sequenciamento de DNA após sequenciar o RNA com sucesso ao estudar a insulina. Sanger não foi o primeiro cientista a se envolver com o sequenciamento de DNA. No entanto, seus métodos inteligentes de sequenciamento de DNA - desenvolvidos em conjunto com os colegas Berg e Gilbert - ganharam o Prêmio Nobel em 1980.

Sanger conhecia o valor potencial de seu trabalho e muitas vezes colaborou com outros cientistas que compartilhavam seus interesses em DNA, biologia molecular e ciências da vida.

Embora lentos e caros em comparação com as tecnologias de sequenciamento de hoje, os métodos de sequenciamento de DNA de Sanger foram elogiados na época. Após tentativa e erro, Sanger encontrou a “receita” bioquímica secreta para separar fitas de DNA, criando mais DNA e identificando a ordem dos nucleotídeos em um genoma.

Materiais de alta qualidade podem ser comprados prontamente para uso em estudos de laboratório:

• DNA polimerase é a enzima necessária para fazer o DNA.
• DNA primer diz à enzima onde começar a trabalhar na fita de DNA.
• dNTPs são moléculas orgânicas compostas de açúcar desoxirribose e trifosfatos de nucleosídeo - dATP, dGTP, dCTP e dTTP - que montam proteínas
• Terminadores de cadeia são nucleotídeos coloridos, também chamados de nucleotídeos terminadores para cada base - A, T, C e G.

Sanger descobriu como cortar o DNA em pequenos segmentos usando a enzima DNA polimerase.

Ele então fez mais DNA a partir de um molde e inseriu traçadores radioativos no novo DNA para demarcar seções das fitas separadas. Ele também reconheceu que a enzima precisava de um primer que pudesse se ligar a um ponto específico na fita modelo. Em 1981, Sanger fez história novamente ao descobrir o genoma dos 16.000 pares de bases do DNA mitocondrial.

A temperatura deve ser ajustada cuidadosamente ao longo do processo de sequenciamento. Primeiro, os produtos químicos são adicionados a um tubo e aquecidos para desfazer (desnaturar) a fita dupla Molécula de DNA. Em seguida, a temperatura é resfriada, permitindo a colagem do primer.

Em seguida, a temperatura é elevada para estimular a atividade ideal da DNA polimerase (enzima).

A polimerase normalmente usa os nucleotídeos normais disponíveis, que são adicionados em uma concentração mais alta. Quando a polimerase chega a um nucleotídeo ligado ao corante de "terminação de cadeia", a polimerase para, e o cadeia termina aí, o que explica por que os nucleotídeos tingidos são chamados de "terminação de cadeia" ou “Terminadores.”

O processo continua muitas e muitas vezes. Eventualmente, o nucleotídeo ligado ao corante foi colocado em cada posição da sequência de DNA. Eletroforese em gel e programas de computador podem, então, identificar as cores dos corantes em cada uma das fitas de DNA e descobrir toda a sequência de DNA com base no corante, a posição do corante e o comprimento do vertentes.

Sequenciamento de alto rendimento - geralmente referido como sequenciamento de última geração - usa novos avanços e tecnologias para sequenciar bases de nucleotídeos de forma mais rápida e econômica do que nunca. Uma máquina de sequenciamento de DNA pode facilmente lidar com trechos de DNA em grande escala. Na verdade, todos os genomas podem ser feitos em questão de horas, em vez de anos com as técnicas de sequenciamento de Sanger.

Os métodos de sequenciamento de última geração podem lidar com análises de alto volume de DNA sem a etapa adicional de amplificação ou clonagem para obter DNA suficiente para o sequenciamento. As máquinas de sequenciamento de DNA executam várias reações de sequenciamento ao mesmo tempo, o que é mais barato e rápido.

Essencialmente, a nova tecnologia de sequenciamento de DNA executa centenas de reações de Sanger em um microchip pequeno e facilmente legível que é executado por meio de um programa de computador que monta a sequência.

A técnica lê fragmentos de DNA mais curtos, mas ainda é mais rápida e eficiente do que os métodos de sequenciamento de Sanger, portanto, mesmo projetos em grande escala podem ser concluídos rapidamente.

O Projeto Genoma Humano, concluído em 2003, é um dos estudos de sequenciamento mais famosos feitos até hoje. De acordo com um artigo de 2018 em Notícias de ciência, o genoma humano consiste em aproximadamente 46.831 genes, que foi um desafio formidável para a sequência. Os principais cientistas de todo o mundo passaram quase 10 anos colaborando e prestando consultoria. Liderado pela National Human Genome Research

Institute, o projeto mapeou com sucesso o genoma humano usando uma amostra composta retirada de doadores de sangue anônimos.

O Projeto Genoma Humano se baseou em métodos de sequenciamento de cromossomos artificiais bacterianos (baseados em BAC) para mapear os pares de bases. A técnica usou bactérias para clonar fragmentos de DNA, resultando em grandes quantidades de DNA para sequenciamento. Os clones foram então reduzidos em tamanho, colocados em uma máquina de sequenciamento e montados em trechos que representam o DNA humano.

Novas descobertas em genômica estão mudando profundamente as abordagens de prevenção, detecção e tratamento de doenças. O governo comprometeu bilhões de dólares em pesquisas de DNA. A aplicação da lei depende da análise de DNA para resolver os casos. Os kits de teste de DNA podem ser adquiridos para uso doméstico para pesquisar ancestrais e identificar variantes de genes que podem representar riscos à saúde:

• Análise genômica envolve comparar e contrastar as sequências do genoma de muitas espécies diferentes nos domínios e reinos da vida. O sequenciamento de DNA pode revelar padrões genéticos que lançam uma nova luz sobre quando certas sequências foram introduzidas evolutivamente. Ancestrais e migrações podem ser rastreados por meio de análise de DNA e comparados a registros históricos.

• Avanços na medicina estão acontecendo em uma taxa exponencial porque virtualmente todas as doenças humanas têm um componente genético. O sequenciamento de DNA ajuda cientistas e médicos a entender como vários genes interagem entre si e com o meio ambiente. O sequenciamento rápido do DNA de um novo micróbio que causa o surto de uma doença pode ajudar a identificar medicamentos e vacinas eficazes antes que o problema se torne um problema sério de saúde pública. Variantes de genes em células cancerosas e tumores podem ser sequenciados e usados ​​para desenvolver terapias genéticas individualizadas.

• Ciência forense aplicativos têm sido usados ​​para ajudar a aplicação da lei a resolver milhares de casos difíceis desde o final dos anos 1980, de acordo com o Instituto Nacional de Justiça. As evidências da cena do crime podem conter amostras de DNA de osso, cabelo ou tecido corporal que podem ser comparadas ao perfil de DNA de um suspeito para ajudar a determinar a culpa ou inocência. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método comumente usado para fazer cópias de DNA a partir de vestígios de evidências antes do sequenciamento.

• Sequenciando espécies recém-descobertas pode ajudar a identificar quais outras espécies estão mais intimamente relacionadas e revelar informações sobre a evolução. Os taxonomistas usam “códigos de barras” de DNA para classificar os organismos. De acordo com Universidade da georgia em maio de 2018, havia cerca de 303 espécies de mamíferos a serem descobertas.

• Teste genético para doenças procure variantes de genes mutados. A maioria são polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), o que significa que apenas um nucleotídeo na sequência é alterado da versão “normal”. Fatores ambientais e estilo de vida afetam como e se certos genes são expressos. Empresas globais disponibilizam tecnologias de sequenciamento de última geração para pesquisadores em todo o mundo interessados ​​em interações multigênicas e sequenciamento de genoma completo.

• Kits de Genealogia de DNA usar sequências de DNA em seu banco de dados para verificar se há variantes nos genes de um indivíduo. O kit requer uma amostra de saliva ou cotonete que é enviado a um laboratório comercial para análise. Além das informações de ancestralidade, alguns kits podem identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou outros variantes genéticas bem conhecidas, como os genes BRCA1 e BRCA2 associados a risco elevado de mama feminina e cancro do ovário.

As novas tecnologias geralmente vêm com a possibilidade de benefícios sociais, bem como de danos; exemplos incluem usinas nucleares com defeito e armas nucleares de destruição em massa. As tecnologias de DNA também trazem riscos.

Preocupações emocionais sobre sequenciamento de DNA e ferramentas de edição de genes como CRISPR incluem temores de que o a tecnologia pode facilitar a clonagem humana ou levar a animais transgênicos mutantes criados por um malandro cientista.

Mais frequentemente, as questões éticas relacionadas ao sequenciamento de DNA estão relacionadas ao consentimento informado. O fácil acesso ao teste de DNA direto ao consumidor significa que os consumidores podem não compreender totalmente como suas informações genéticas serão usadas, armazenadas e compartilhadas. Os leigos podem não estar emocionalmente preparados para aprender sobre suas variantes genéticas defeituosas e riscos à saúde.

Terceiros, como empregadores e seguradoras, podem discriminar indivíduos portadores de genes defeituosos que podem dar origem a problemas médicos graves.