A clonagem molecular é um método de biotecnologia comum com o qual todo estudante e pesquisador deve estar familiarizado. A clonagem molecular usando um tipo de enzima chamada enzima de restrição para cortar o DNA humano em fragmentos que podem ser inseridos no DNA plasmídico de uma célula bacteriana. As enzimas de restrição cortam o DNA de fita dupla pela metade. Dependendo da enzima de restrição, o corte pode resultar em uma extremidade pegajosa ou embotada. As extremidades pegajosas são mais úteis na clonagem molecular porque garantem que o fragmento de DNA humano seja inserido no plasmídeo na direção certa. O processo de ligação, ou fusão de fragmentos de DNA, requer menos DNA quando o DNA tem extremidades pegajosas. Por último, várias enzimas de restrição de extremidade pegajosa podem produzir a mesma extremidade pegajosa, embora cada enzima reconheça uma sequência de restrição diferente. Isso aumenta a probabilidade de que a região de interesse do DNA seja cortada por enzimas de extremidade pegajosa.
Enzimas de restrição e locais de restrição
As enzimas de restrição são enzimas que cortam sequências específicas reconhecidas no DNA de fita dupla e cortam o DNA pela metade nessa sequência. A sequência reconhecida é chamada de sítio de restrição. As enzimas de restrição são chamadas de endonucleases porque cortam o DNA de fita dupla, que é como o DNA normalmente existe, em locais que estão entre as extremidades do DNA. Existem mais de 90 enzimas de restrição diferentes. Cada um reconhece um local de restrição distinto. As enzimas de restrição clivam seus respectivos locais de restrição 5.000 vezes mais eficientemente do que outros locais que não reconhecem.
A orientação certa
As enzimas de restrição vêm em duas classes gerais. Eles cortam o DNA em pontas adesivas ou pontas cegas. Uma extremidade pegajosa tem uma curta região de nucleotídeos, os blocos de construção do DNA, que não é pareada. Essa região desemparelhada é chamada de saliência. A saliência é considerada pegajosa porque deseja e irá emparelhar com outra extremidade pegajosa que possui uma sequência de saliência complementar. As pontas pegajosas são como gêmeos há muito perdidos que procuram se abraçar com força quando se encontram. Por outro lado, as extremidades cegas não são pegajosas porque todos os nucleotídeos já estão emparelhados entre as duas fitas de DNA. A vantagem das extremidades coesivas é que um fragmento de DNA humano só pode se encaixar em um plasmídeo bacteriano em uma direção. Em contraste, se o DNA humano e o plasmídeo bacteriano tiverem extremidades cegas, o DNA humano pode ser inserido cabeça com cauda ou cauda com cabeça no plasmídeo.
Ligadura de extremidades pegajosas requer menos DNA
Embora o DNA com pontas adesivas tenha mais facilidade para se encontrar por causa de sua “pegajosidade”, nem as pontas pegajosas nem as pontas cegas podem se fundir em um pedaço contínuo de DNA. A formação de um pedaço contínuo de DNA que está completamente ligado requer uma enzima chamada ligase. As ligases conectam as estruturas dos nucleotídeos nas extremidades pegajosas ou cegas, resultando em uma cadeia contínua de nucleotídeos. Como as extremidades adesivas se encontram mais rapidamente devido à atração entre elas, o processo de ligação requer menos DNA humano e menos DNA plasmídico. As extremidades cegas do DNA e dos plasmídeos têm menos probabilidade de se encontrarem e, portanto, a ligação das extremidades cegas requer que mais DNA seja colocado no tubo de ensaio.
Diferentes enzimas podem fornecer a mesma extremidade pegajosa
Os locais de restrição estão localizados em todo o genoma dos organismos, mas não estão uniformemente espaçados. Em plasmídeos, eles podem ser projetados para serem localizados lado a lado. Os cientistas que desejam cortar um fragmento de DNA humano do genoma humano devem encontrar locais de restrição que estão na frente e atrás da região do fragmento. Além de garantir que um fragmento de DNA seja inserido na direção certa, diferentes enzimas de extremidade pegajosa podem criar a mesma extremidade pegajosa, embora reconheçam sequências de restrição diferentes. Por exemplo, BamHI, BglII e Sau3A têm sequências de reconhecimento diferentes, mas produzem a mesma extremidade pegajosa de GATC. Isso aumenta a probabilidade de que haja locais de restrição de extremidade pegajosa que flanqueiam seu gene humano de interesse.