A espectrofotometria é uma ferramenta valiosa em química e biologia. A ideia básica é simples: diferentes substâncias absorvem luz / radiação eletromagnética melhor em alguns comprimentos de onda do que em outros. É por isso que alguns materiais são transparentes enquanto outros são coloridos, por exemplo. Quando você irradia luz de um determinado comprimento de onda através de uma solução, quanto maior sua concentração, mais luz ela absorverá. Para calcular a concentração, você precisa comparar sua leitura com as leituras de padrões de concentração conhecida. O procedimento a seguir é um procedimento bastante genérico escrito com um laboratório de ensino de química em mente, mas também pode ser modificado para outras configurações.
Como sempre, ao trabalhar em um laboratório, coloque seus óculos de proteção, luvas e casaco de manga comprida para garantir sua própria segurança.
Aperte o bulbo de borracha para esvaziá-lo de ar e, em seguida, coloque-o sobre a pipeta graduada e deixe que o bulbo relaxe para que ele sugue a água para dentro da pipeta. Em seguida, remova o bulbo e tampe o topo da pipeta com o dedo; isso irá selar a pipeta de forma que a solução interna não flua para fora até que seu dedo seja removido. Levante ligeiramente a ponta do dedo para deixar um pouco de solução escorrer para fora da pipeta, até atingir o volume desejado. Pratique com um pouco de água e um copo para ter uma ideia de como a pipeta graduada funciona. O link na seção Recursos contém um clipe de filme para mostrar como usar uma pipeta, caso você nunca tenha trabalhado com uma antes.
Identifique 5 tubos de ensaio como padrões 1-5. Você pode etiquetá-los usando fita adesiva e uma caneta ou usando um marcador de apagamento a seco.
Escolha cinco concentrações para seus padrões. Você deseja que as concentrações padrão sejam separadas umas das outras por aproximadamente o mesmo intervalo - por exemplo, 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar, etc. - e aproximadamente na mesma faixa que você espera que o seu desconhecido esteja. Por enquanto, use as cinco concentrações a seguir, mas lembre-se de que você precisará modificá-las ao realizar seu próprio experimento:
Padrão 1: 0,1 molar Padrão 2: 0,2 molar Padrão 3: 0,3 molar Padrão 4: 0,4 molar Padrão 5: 0,5 molar
Em seguida, pegue a solução padrão 1 molar e adicione as seguintes quantidades aos tubos de ensaio 1-5. Lembre-se de que esses valores são calculados usando as concentrações listadas acima, portanto, você pode precisar modificá-los conforme necessário ao realizar seu próprio experimento.
Padrão 1: 0,8 mililitros Padrão 2: 1,6 mililitros Padrão 3: 2,4 mililitros Padrão 4: 3,2 mililitros Padrão 5: 4 mililitros
Enxágue a pipeta graduada e, em seguida, transfira as seguintes quantidades de água desionizada:
Padrão 1: 7,2 mililitros Padrão 2: 6,4 mililitros Padrão 3: 5,6 mililitros Padrão 4: 4,8 mililitros Padrão 5: 4,0 mililitros
Basicamente, a ideia é levar a quantidade de solução em cada tubo para 8 mililitros.
Tampe cada um dos tubos padrões com parafilme e inverta-os para misturar.
Marque outros cinco tubos de ensaio como "Desconhecido 1-5." Adicione a cada uma delas as mesmas quantidades de sua solução desconhecida ou de teste que você usou com a solução 1 molar para os padrões. Em outras palavras, o desconhecido 1 conterá 0,8 mililitros de solução de teste e 7,2 mililitros de água, desconhecido 2 conterá 1,6 mililitros de solução de teste e 6,4 mililitros de água, e assim para frente.
Tampe cada uma das incógnitas com parafilme e inverta cuidadosamente para misturar.
Ligue o espectrofotômetro e deixe-o aquecer. O tempo necessário dependerá do modelo e do fabricante.
Defina o comprimento de onda no espectrofotômetro. O comprimento de onda dependerá do tipo de produto químico em seu experimento. Por enquanto, suponha 500 nm, embora lembre-se de que você precisará alterar isso para experimentos diferentes.
Calibre seu espectrofotômetro. O procedimento de calibração irá variar dependendo do dispositivo que você está usando. Para o Spectronic 20, um modelo comum em laboratórios de ensino, primeiro você ajustará a máquina para que leia "0 por cento T" quando nenhuma cubeta for carregada, ajuste-a para que leia "100% T" quando uma cubeta em branco contendo apenas água deionizada estiver carregado. Esses procedimentos podem variar dependendo do tipo de máquina que você está usando, portanto, consulte as instruções do fabricante para obter detalhes.
Após a calibração da máquina, pegue o tubo de ensaio padrão 1 e despeje o conteúdo em uma cubeta limpa até atingir a linha de preenchimento. Limpe a cubeta com um kimwipe para remover quaisquer impressões digitais ou outra sujeira. Insira a cubeta no espectrofotômetro e registre a leitura de "% T".
Repita este procedimento para todas as 10 amostras. ESTEJA CERTO de limpar a cubeta entre as amostras para garantir que seus resultados sejam os mais precisos possíveis.
Pegue os resultados de seus padrões e insira-os em uma planilha / programa de gráficos como Excel ou OpenOffice.
Usando o programa de planilha, divida 100 por cento por cada um dos valores "% T" dos padrões e, a seguir, obtenha o registro do resultado. Este cálculo dará a você a absorbância. Se você inserir a fórmula, seu programa de planilha fará o cálculo para você.
Exemplo: Se% T for 50,6, a fórmula que você inseriu no programa de planilha seria a seguinte:
log (100 / 50,6)
O programa de planilha fará a aritmética.
Faça o mesmo para todos os cinco valores desconhecidos / experimentais.
Represente graficamente os valores de absorbância para todos os cinco padrões, com concentração no eixo xe absorbância no eixo y. Usando o programa de planilha, ajuste uma equação linear a este gráfico. A equação terá a forma y = mx + b. A maioria dos programas de planilha terá uma função de regressão linear. Consulte o manual do usuário do seu programa de planilha para obter detalhes sobre como usar o recurso de regressão linear.
Pegue a equação para a linha de melhor ajuste de seu programa de planilha e resolva para y subtraindo b de ambos os lados e dividindo ambos os lados por m. O resultado será semelhante ao seguinte:
(y - b) / m = x
onde b e m são valores encontrados por seu programa de planilha.
Verifique seus valores de absorbância para as incógnitas e escolha três que estejam mais ou menos na mesma faixa dos padrões. Use esses três valores de absorbância para os cálculos restantes. Se todos os cinco estiverem no mesmo intervalo dos padrões, você poderá usar todos os cinco, mas precisará usar pelo menos três.
Conecte cada um dos três valores de absorbância em sua equação no lugar de y. Lembre-se de que sua equação estava na seguinte forma:
(y - b) / m = x
Portanto, você deseja inserir o valor de absorbância de cada incógnita na equação no lugar de y e, em seguida, calcular x. Você pode usar o programa de planilha para fazer esse cálculo para você e torná-lo mais rápido. Você agora calculou a concentração do produto químico de interesse em três de suas incógnitas diluídas. A solução original foi diluída para preparar essas incógnitas, no entanto, agora você precisa voltar atrás e calcular a concentração da solução original com base no fator de diluição.
Cada amostra desconhecida inserida no espectrofotômetro foi diluída em uma quantidade diferente. Consequentemente, você deve agora dividir a concentração que você calculou com base na absorbância para cada leitura desconhecida pelo seguinte:
Desconhecido 1: Divisão por 0,1 Desconhecido 2: Divisão por 0,2 Desconhecido 3: Divisão por 0,3 Desconhecido 4: Divisão por 0,4 Desconhecido 5: Divisão por 0,5
Lembre-se, no entanto, de que esses números se baseiam na suposição de que você está usando as diluições descritas acima. Lembre-se de alterar esses valores se você diluiu suas amostras em uma quantidade diferente.
Some seus resultados e divida-os pelo número de resultados. Isso lhe dará uma média. Relate esse número como sua descoberta para a concentração da solução original.
Coisas que você precisa
- Lápis
- Papel
- Calculadora
- Luvas
- Óculos
- Casaco de mangas compridas
- Espectrofotômetro
- Cuvetes de vidro
- Parafilme
- Kimwipes
- Água desionizada
- Solução que você deseja testar (de concentração desconhecida)
- Solução padrão 1 molar do produto químico presente em sua solução de teste
- Pipeta graduada e bulbo
- Tubos de ensaio e suporte para tubos de ensaio
- Taça
Pontas
Este procedimento pode parecer complicado, mas na verdade é bastante simples depois de iniciado. Tente assistir aos dois vídeos na seção Recursos para se familiarizar com o procedimento.