As enzimas possuem uma estrutura tridimensional definida. Qualquer mudança nesta estrutura causa uma mudança na atividade da enzima. O pH da mistura de reação modifica essa estrutura e, portanto, a atividade. Cada enzima tem um pH ótimo onde mostra atividade máxima. Diferenças significativas deste pH causam mudanças na estrutura tridimensional da enzima que reduzem sua atividade. A enzima catecol oxidase tem um pH ótimo de cerca de 7.
Sobre Catecol Oxidase
O catecol é oxidado pela catecol oxidase na presença de oxigênio para formar benzoquinona, que, por exposição ao ar, forma melanina. Essa enzima também é conhecida por outros nomes, como tirosinase, difenol oxidase e polifenol oxidase. Batatas, maçãs e bananas contêm catecol oxidase, que atua sobre o catecol incolor e o converte em melanina de cor marrom. O escurecimento que ocorre quando você corta e expõe esses itens ao ar é o resultado dessa reação.
Extração de Catecol Oxidase
A catecol oxidase pode ser extraída de bananas ou batatas. Amasse uma banana com o dobro do volume de água em um pilão. Alternativamente, misture uma banana com água para obter o extrato de catecol oxidase. Filtre através da manteiga de musselina e guarde na geladeira. Se você usar batatas, descasque-as e pique-as e bata em alta velocidade usando 700 ml de água destilada fria. Filtre o suco de batata com um pano de algodão e leve à geladeira.
Detalhes experimentais
Prepare soluções tampão com valores de pH 2, 4, 6, 7 e 8. Identifique cinco tubos de ensaio com esses valores de pH. Encha cada tubo até um quarto da capacidade com o respectivo tampão. Adicione 10 gotas de extrato de catecol oxidase em cada um desses tubos, seguido por 10 gotas de catecol. Agite os tubos e anote a cor de cada tubo em uma escala de 0 a 5, onde 0 indica nenhuma cor e 5 indica uma cor marrom escura. Continue agitando os tubos e observe a cor a cada cinco minutos durante os próximos 20 minutos.
Interpretação do resultado
Use os dados obtidos para a leitura de 20 minutos para traçar um gráfico. No eixo X, indique o pH dos buffers. No eixo Y, indique as intensidades de cor variando de 0 a 5. Para cada valor de pH, marque a intensidade da cor e junte essas marcações para obter o gráfico final. Localize o pico deste gráfico e identifique o pH ideal para a reação da catecol oxidase. Desde que você tenha realizado o experimento corretamente, o valor de pH ideal será 7. Em pH 7, a enzima é mais ativa e catalisa rapidamente a oxidação do catecol para dar a cor marrom escura.
Precauções
Tanto as bananas como as batatas contêm catecol. Portanto, existe a possibilidade de algum deste oxidar durante a reação, contribuindo para a intensidade da cor que você observa. Para evitar essa reação, mantenha o extrato de catecol oxidase em um bloco de gelo antes de adicioná-lo a cada tubo. O catecol é venenoso, então certifique-se de não permitir que ele entre em contato com sua pele. Não pipete soluções de catecol e se houver derramamento, use luvas para limpá-lo com toalhas de papel.