Podstawowe składniki HPLC

Wysokosprawna chromatografia cieczowa to technika analizy laboratoryjnej mieszaniny. Jest to wydajny rodzaj chromatografii, który wykorzystuje wysokie ciśnienie, a nie po prostu grawitację, aby przenieść próbkę mieszaniny przez kolumnę. Próbka jest wstrzykiwana, a pompa o wysokim ciśnieniu pomaga przemieszczać próbkę wzdłuż kolumny z wypełnieniem, gdzie jest rozdzielana na poszczególne składniki. To oddzielenie jest następnie analizowane przez detektor w celu uzyskania wyników.

W celu wstrzyknięcia do HPLC, próbka musi być najpierw rozpuszczona w polarnym ciekłym rozpuszczalniku, najlepiej takim ze znanymi widmami HPLC, aby można było odróżnić jej dane od danych próbki. Płynny roztwór zawierający próbkę umieszcza się w przyrządzie i przesyła do kolumny. Rzeczywista lokalizacja miejsca wstrzyknięcia zależy od marki instrumentów. W większości przypadków proces wstrzykiwania jest zautomatyzowany, ale w niektórych przypadkach pracownik laboratorium musi wstrzyknąć próbkę za pomocą małej igły do ​​strzykawki.

Komponent pompy jednostki HPLC jest niezbędny, ponieważ zapewnia ciśnienie, które napędza próbkę przez kolumnę. Siła pompy jest różna, ale mocna może wytworzyć ciśnienie dochodzące do 6000 psi lub funtów na cal kwadratowy, które jest stosowane po wstrzyknięciu próbki. Dzięki temu próbka przechodzi przez kolumnę szybciej i wydajniej, niż gdyby przeciekała przy użyciu wyłącznie siły grawitacji.

Zwiększona prędkość próbki przepuszczanej przez kolumnę przez pompę pozwala na zastosowanie innego typu kolumny niż te stosowane w prostej chromatografii cieczowej. Materiał wypełniający w kolumnie może mieć znacznie mniejszą wielkość cząstek, co zwiększa pole powierzchni, a zatem wspomaga interakcje próbki z kolumną. Większość kolumn HPLC działa poprzez polaryzację. Próbka jest rozpuszczana w rozpuszczalniku polarnym, a kolumna składa się w dużej mierze z węglowodorów niepolarnych. Polarne części cząsteczki próbki bardzo szybko przechodzą przez kolumnę, ponieważ wchodzą w interakcję głównie z rozpuszczalnika, podczas gdy niepolarne składniki próbki pozostają w kolumnie, tworząc słabe oddziaływania z kolumną składniki. Dlatego składniki próbki schodzą z kolumny w kolejności od najbardziej polarnej do najbardziej niepolarnej.

Detektory różnią się również w zależności od typu używanego urządzenia HPLC. Jednak większość działa w ten sam podstawowy sposób. Źródło światła ultrafioletowego pada na oddzielone składniki próbki, gdy schodzą one z kolumny. Większość związków organicznych absorbuje pewną ilość światła, więc przechodząc przez przyłożoną wiązkę światła, detektor może wykryć, ile światła zostało zaabsorbowane. Detektor rejestruje również czas retencji składników na podstawie kolejności ich schodzenia z kolumny. Wynik ten można następnie analizować w oparciu o powierzchnię piku, aby określić dokładny charakter składników próbki.