Fordeler og ulemper ved Western Blot

Western blot, en analytisk teknikk som brukes til å finne et spesifikt protein i en gitt prøve, benytter evnen til et enzym eller fluorescensmerket primært antistoff til å binde seg til det spesifikke antigenet. Det er en tretrinnsprosess som begynner med gelelektroforese, etterfulgt av membranblotting og sondering med antistoffer. Proteindeteksjon kan være direkte eller indirekte, hvor sistnevnte bruker et merket sekundært antistoff rettet mot det primære. Selv om det er akseptert som en rutinemessig analyseteknikk for proteiner, har Western blot begrensninger så vel som fordeler.

En av de største argumentene for Western blot er dens følsomhet. På grunn av dets evne til å oppdage så lite som 0,1 nanogram protein i en prøve, kan teknikken teoretisk tjene som et effektivt tidlig diagnostisk verktøy som registrerer selv den minste immunogene responsen fra et virus eller bakterier hos en pasient prøve. En indirekte western blot bygger videre på denne følsomheten fra det sekundære antistoffets evne til å forsterke intensiteten av signalet oppdaget av bildesystemet. Større følsomhet betyr at færre antistoffer er nødvendig for testing, noe som reduserer laboratoriekostnadene betydelig.

Western blot-teknikken skylder sin spesifisitet to store medvirkende faktorer. For det første sorterer gelelektroforese en prøve i proteiner av ulik størrelse, ladning og konformasjon. Denne prosessen er i seg selv et stort skritt mot påvisning, ettersom bånd dannet i gelen allerede gir ledetråder om størrelsen på proteinet eller polypeptidet av interesse. Spesifisiteten av antistoff-antigen-interaksjonen fungerer som den andre store faktoren. Fordi spesifikke antistoffer viser affinitet for spesifikke proteiner, kan prosessen selektivt oppdage et målprotein selv i en blanding av 300 000 forskjellige proteiner.

Til tross for sin følsomhet og spesifisitet kan en Western blot fremdeles gi feilaktige resultater. Et falskt positivt resultat når et antistoff reagerer med et ikke-tiltenkt protein, som ofte er det skjer når en pasient som blir testet for HIV tilfeldigvis har tuberkulose eller en rekke parasittiske infeksjoner. Et falsk-negativt, derimot, kan lett oppstå hvis større proteiner ikke får tilstrekkelig tid til å overføre ordentlig til membranen. Feil blotting og prosessering gir ofte skjevt, falmet eller til og med flere bånd, noe som gjør testresultatene underlagt teknikerens tolkning.

Kostnaden for en western blot er en sammensetning av de store individuelle utgiftene til merkede antistoffer, dyktige analytikere og laboratorieutstyr. En delikat prosess, western blotting krever presisjon i hvert trinn for riktig identifisering av bestanddelene til en prøve. En mindre feil i reagenskonsentrasjonen eller i inkubasjonsperioden kan være katastrofal for hele prosessen. Til slutt kan utstyret som kreves for deteksjon og avbildning - kjemiluminescerende, fluorescerende, radioaktive eller laserdeteksjonssystemer - være for dyrt for den gjennomsnittlige mikrobiologienheten.