I molekylærbiologi kan godt buffervalg og forberedelse for forskjellige DNA-isolasjonstrinn være forskjellen mellom å gå videre til proteinuttrykk eller åpne et annet maxi-prep kit for å starte over. Til tross for deres avgjørende betydning, er bufferoppskrifter ofte bare det - oppskrifter skrevet uten forklaring eller begrunnelse for de forskjellige komponentene. En slik buffer er glukose-tris-EDTA eller GTE-buffer.
Hva brukes GTE til?
GTE brukes til å resuspendere bakteriecellepellets før lysering (brytes opp) cellene og høsting av plasmid-DNA inni. Lysozym, som myker cellemembranene, tilsettes ofte sammen med GTE-bufferen. Å oppnå en homogen suspensjon av hele celler i løpet av dette trinnet, slik at den deretter tilsatte lyseringsløsningen kan komme til alle cellene, er nøkkelen til å få gode DNA-utbytter. GTE er designet for å gjøre dette samtidig som det gir et stabilt miljø for DNA.
Glukose for osmolaritet
50mM (millimolar) glukose sukker tilsettes til GTE-buffer for å opprettholde osmolaritet der den oppløste konsentrasjonen utenfor cellene er nær den som er inne i cellene. Dette forhindrer for tidlig cellelyse, noe som kan forårsake lavere DNA-avkastning på grunn av aggregering og nedbrytning. De andre komponentene i bufferen bidrar også til løsningens osmolaritet, men glukose, å være en ikke-elektrolytt, er et godt valg fordi det ikke forstyrrer løsningens buffer eiendommer.
Tris for pH-stabilitet
Tris er det korte navnet på tris (hydroksymetyl) aminometan, som er en veldig vanlig pH-buffer. I tilfelle av GTE-buffer tilsettes syresaltet (Tris-HCl) til bufferen i en konsentrasjon på 25 mM. Dette opprettholder pH i løsningen på en nesten fysiologisk 8,0, en ideell pH for å forhindre syrehydrolyse (nedbrytning) av plasmid-DNA og uønskede sidereaksjoner av de andre cellekomponentene.
EDTA forhindrer DNA-nedbrytning
EDTA, eller etylendiamintetraeddiksyre, fanger opp eller "chelaterer" metallioner ut av løsningen, og forhindrer dem i å delta i uønskede bivirkninger. I GTE-buffer tilsettes EDTA ved 10mM. Dens primære formål er i bufferen for å avrunde gratis sink, magnesium og kalsium, og derved forhindre DNA-nedbrytning ved visse veier som krever metallene.
Noen viktige tips
Hold GTE-bufferen kald og lag den i små mengder for å forhindre vekst av utilsiktede bakterier i den. Sukker og kontrollert pH gir et flott vekstmedium. Bruk alltid renset vann. Tappevann kan ha et overskudd av metallioner fra rørene, noe som kan overvelde EDTAs evne til å fange opp. Hvis du mistenker at det er forstyrrende RNA i prøven din, kan du legge til RNase A med 100 mikrogram per milliliter til GTE-bufferen for å eliminere problemet.