Biokjemikere og molekylærbiologer bruker elektroforese for å skille makromolekyler som proteiner og nukleinsyrer. Dette gjør det mulig for forskere å isolere og analysere individuelle proteiner eller nukleinsyresekvenser i en kompleks blanding. Et typisk eksempel på elektroforese i laboratoriet er en mikrobiolog som bruker Polymerase Chain Reaction (PCR) for å skille DNA-fragmenter produsert i et mikrobielt samfunn. Uansett formål krever elektroforese alltid bruk av en bufferløsning.
TL; DR (for lang; Leste ikke)
Elektroforese skiller makromolekyler som protein og nukleinsyrer etter størrelse, ladning og andre egenskaper. For elektroforese som skiller seg fra ladning, bruker forskere buffer for å overføre ladningen gjennom gelen. Buffer holder også gelen på en stabil pH, og minimerer endringer som kan forekomme i proteinet eller nukleinsyren hvis de utsettes for ustabil pH.
Prinsipper for elektroforese
Elektroforese skiller molekyler langs en gradient basert på størrelse, ladning eller andre egenskaper. Den gradienten kan være et elektrisk felt eller, i tilfellet med denaturerende gradientgelelektroforese (DGGE), et denatureringsmiddel som en blanding av urea og formamid. Proteiner vil vandre mot anoden hvis de er negativt ladet og katoden hvis den er positivt ladet. Siden større molekyler migrerer saktere enn mindre molekyler, kan forskere måle den tilbakelagte avstanden og bruke logaritmer for å bestemme størrelsen på fragmentene.
Denaturerende gradientgelelektroforese
Med DGGE beveger DNA seg langs en gradient av økende denatureringskraft til kraften er tilstrekkelig til å denaturere, eller utfolde, det bestemte DNA-fragmentet helt. På dette punktet stopper migrasjonen. Forskere kan bruke denne metoden til å skille fragmenter basert på deres individuelle følsomhet for denaturering.
Hva bufferen gjør
I tilfelle elektroforese som skilles på grunnlag av ladning, overfører ioner i bufferen ladningen som er nødvendig for separasjon. Buffer, ved å tilveiebringe et reservoar med svak syre og base, holder også pH innenfor et smalt område. Dette er viktig fordi strukturen og ladningen til et protein eller nukleinsyre vil endres hvis de blir utsatt for betydelige pH-endringer, og dermed forhindre riktig separasjon.
Typiske buffere
Ulike buffere er ideelle for å opprettholde elektroforesegelen i forskjellige ønskede pH-områder. Typiske buffere som brukes av forskere for dette formålet inkluderer eddiksyre, borsyre, fosforsyre og sitronsyre, så vel som glycin og taurin. Generelt bør pKa-verdien (syredissosiasjonskonstant) være nær den nødvendige pH. Det er å foretrekke fremfor buffere som gir lav ladestørrelse for ikke å lede for mye strøm.
