Polymerasekettingreactie, of PCR, is een techniek die één fragment van DNA in vele fragmenten kopieert - exponentieel veel. De eerste stap bij PCR is om het DNA te verhitten zodat het denatureert of smelt tot enkele strengen. De structuur van DNA is als een touwladder waarin de sporten touwen zijn met magnetische uiteinden. De magneten verbinden zich om de sporten te vormen, basenparen genoemd, en kunnen dus niet uit elkaar worden getrokken. Elk DNA-fragment smelt bij verschillende temperaturen tot enkele strengen. Begrijpen hoe de structuur van DNA bij elkaar wordt gehouden door de afzonderlijke delen van DNA, zal inzicht geven in waarom verschillende DNA-fragmenten smelten bij verschillende temperaturen en waarom zulke hoge temperaturen nodig zijn in de eerste? plaats.
Smeltend! Smeltend!
De eerste stap van PCR is om het DNA te smelten zodat dubbelstrengs DNA zich scheidt in enkelstrengs DNA. Voor zoogdier-DNA omvat deze eerste stap gewoonlijk een hitte van ongeveer 95 graden Celsius (ongeveer 200 Fahrenheit). Bij deze temperatuur breken de waterstofbruggen tussen de A-T- en G-C-basenparen, of sporten in de DNA-ladder, uit elkaar, waardoor het dubbelstrengs DNA wordt opengeritst. De temperatuur is echter niet hoog genoeg om de fosfaat-suikerruggengraat te breken die de enkele strengen of de palen van de ladder vormt. Volledige scheiding van enkelvoudige strengen bereidt ze voor op de tweede stap van PCR, die afkoelt om korte DNA-fragmenten, primers genaamd, toe te staan om de enkelvoudige strengen te binden.
Magnetische ritsen
Een van de redenen waarom DNA wordt verwarmd tot de hoge temperatuur van 95 graden Celsius, is dat hoe langer de dubbele DNA-streng is, hoe meer het bij elkaar wil blijven. DNA-lengte is een factor die het smeltpunt beïnvloedt dat voor PCR op dat stuk DNA wordt gekozen. De A-T- en G-C-basenparen in het dubbelstrengs DNA binden met elkaar om de dubbelstrengs structuur bij elkaar te houden. Hoe meer opeenvolgende basenparen tussen twee enkelstrengs gebonden zijn, hoe meer hun buren ook willen binden, en hoe sterker de aantrekkingskracht tussen de twee strengen wordt. Het is als een rits gemaakt van kleine magneten. Als je de rits sluit, zullen de magneten natuurlijk willen dichtritsen en dichtgeritst blijven.
Sterkere magneten blijven steviger plakken
Een andere factor die van invloed is op de smelttemperatuur die moet worden gekozen voor uw DNA-fragment van belang, is de hoeveelheid G-C-basenparen die in dat fragment aanwezig zijn. Elk basenpaar is als twee minimagneten die elkaar aantrekken. Een paar gemaakt van G en C wordt veel sterker aangetrokken dan een A en T paar. Dus een stuk DNA dat meer G-C-paren heeft dan een ander fragment, heeft een hogere temperatuur nodig voordat het in enkele strengen smelt. DNA absorbeert van nature ultraviolet licht - met een golflengte van 260 nanometer om precies te zijn - en enkelstrengs DNA absorbeert meer licht dan dubbelstrengs DNA. Dus het meten van de hoeveelheid geabsorbeerd licht is een manier om te meten hoeveel je dubbelstrengs DNA is gesmolten tot enkele strengen. Het "magnetische ritssluiting" -effect van GC- en A-T-basenparen is wat een grafiek veroorzaakt van de lichtabsorptie van dubbelstrengs DNA uitgezet tegen een temperatuurstijging om sigmoïdaal te zijn, de vorm van een S, en niet een rechte lijn. De curve van de S vertegenwoordigt de teamwerkweerstand die de basenparen uitoefenen tegen de hitte omdat ze niet willen scheiden.
Het Halverwege
De temperatuur waarbij een stuk DNA in enkele strengen smelt, wordt de smelttemperatuur genoemd, die wordt aangeduid met de afkorting "Tm". Dit geeft de temperatuur aan waarbij de helft van het DNA in een oplossing is gesmolten tot enkelstrengs en de andere helft nog steeds in dubbelstrengs is het formulier. De smelttemperatuur is voor elk DNA-fragment anders. Zoogdier-DNA heeft een G-C-gehalte van 40%, wat betekent dat de resterende 60% van de basenparen As en Ts zijn. Het 40% G-C-gehalte zorgt ervoor dat zoogdier-DNA smelt bij 87 graden Celsius (ongeveer 189 Fahrenheit). Dit is de reden waarom de eerste stap van PCR op zoogdier-DNA is om het te verwarmen tot 94 graden Celsius (201 Fahrenheit). Slechts zeven graden warmer dan de smelttemperatuur en alle dubbele strengen zullen volledig smelten tot enkele strengen.