Vloeibare voedingsbouillon wordt gebruikt om bacteriën zoals Escherichia coli te kweken. Recepten voor deze bouillon variëren afhankelijk van de bacteriesoort en de aanwezigheid van genetische modificaties, bijvoorbeeld antibioticaresistentie. De bouillon kan worden gestold door agar toe te voegen, waardoor de bacteriën verschillende kolonies kunnen vormen, terwijl ze zich in vloeibare cultuur eenvoudig door het volume verspreiden. Dit is een fundamentele maar essentiële techniek voor geavanceerde methoden zoals genklonering of microbiologische tests. Dit artikel gaat ervan uit dat standaard laboratorium Escherichia coli-stammen moeten worden gekweekt op Luria-bouillon (LB)-agarplaten (of petrischalen).
Weeg 10 gram trypton van bacteriële kwaliteit, 5 gram gistextract, 5 gram natriumchloride, 15 gram agar of agarose en 1 milliliter 1N natriumhydroxide af. Meng deze met een hoeveelheid gedestilleerd en geautoclaveerd steriel water tot 1 liter medium is verkregen. Autoclaveer de media in flessen of kolven met een losse dop gedurende 25 minuten. Laat afkoelen tot ongeveer 50 graden Celsius voordat u reagentia toevoegt die bij hoog vuur vernietigd zullen worden, zoals antibiotica of andere voedingssupplementen.
Laat de geautoclaveerde media afkoelen tot 50 graden Celsius en niet lager dan 45 graden Celsius, omdat de agar in de container zal stollen voordat deze kan worden gegoten. Verkrijg steriele petrischalen en giet genoeg om het hele oppervlak van de plaat en ten minste de helft van de diepte te bedekken. Vermijd overvulling van de platen en laat de agar bij voorkeur niet in contact komen met de bovenrand van de schaal. Laat de platen stollen in een steriele omgeving (bijvoorbeeld onder een afzuigkap met laminaire stroming) door de deksels op een hoek van de afzuigkap te laten.
Droog de platen. Hoewel de platen kunnen worden gebruikt zodra ze zijn ingesteld, zal er wat vocht op het oppervlak van de agar aanwezig zijn, waardoor bacteriekolonies zich niet voldoende kunnen hechten. Daarom kunt u de platen het beste drogen voordat u bacteriën aanbrengt, bijvoorbeeld door ze buiten te laten zitten kamertemperatuur voor een paar dagen of voor een half uur onder een laminaire stroom afzuigkap of in een 37 graden Celsius broedmachine.
Bewaar de borden. Gedroogde borden moeten ondersteboven (omgekeerd) op hun deksel worden gestapeld en in hun oorspronkelijke toestand worden teruggebracht verpakking, dichtgeplakt en ofwel in folie gewikkeld ter bescherming tegen licht of in een geschikte container. Schrijf altijd de bereidingsdatum op de borden en vermijd het gebruik als de borden ouder zijn dan 2 maanden.
Referenties
- "Huidige protocollen in de moleculaire biologie"; Karen Elbing en Roger Brent; 2002
Tips
- Voer zoveel mogelijk van de bovenstaande stappen (bij voorkeur alle) uit in een steriele omgeving (bijvoorbeeld onder een open vlam of een kap met laminaire stroming) om te voorkomen dat bacteriële verontreinigingen in de lucht binnendringen en groeien in de media.
Over de auteur
Palmer Owyoung heeft een Master of Arts in internationaal zakendoen behaald aan de University of California in San Diego en een Bachelor of Arts in sociologie van de University of California in Santa Barbara en is een getrainde moleculaire bioloog. Sinds 2006 is hij freelance schrijver. Naast schrijven is hij fulltime Forex-handelaar en internetmarketeer.
Fotocredits
Jupiterimages/Comstock/Getty Images