Gelelektroforese is een veelgebruikte laboratoriumtechniek met veel praktische toepassingen, waaronder DNA-fingerprinting en genoomsequencing. Het proces omvat het scheiden DNA fragmenten met behulp van een elektrische stroom terwijl ze de snelheid van moleculaire beweging volgen door een filtergel.
Door blauwe of oranje volgkleurstof toe te voegen aan kleurloze DNA-monsters, kunt u uw monster zien en informatie verkrijgen over hoe DNA-moleculen bewegen tijdens elektroforese. Identificatie is gebaseerd op de grootte van DNA-banden op de gel na migratie van moleculen.
Hoe gelelektroforese werkt
Gelelektroforese trekt DNA-fragmenten door een gel met behulp van een elektrische stroom om DNA-moleculen te isoleren en te identificeren op grootte en elektrische lading. De gel wordt vaak gemaakt met agarose poeder — een polysacharide geëxtraheerd uit zeewier.
Agarose wordt toegevoegd aan een bufferoplossing van water en zout, en het mengsel wordt verwarmd en afgekoeld om een poreuze gel te maken die zal fungeren als een filtermatrix tijdens de elektroforeseprocedure. De gel wordt vervolgens in een elektroforese-eenheid geplaatst en bedekt met een bufferoplossing die geleidt
elektriciteit.Oplossingen die DNA en laadkleurstoffen bevatten, worden in kleine putjes in de gel gepipetteerd die tijdens de gelbereiding moeten worden gemaakt. kleurstoffenje helpenduidelijk zien de sample die u toevoegt aan de gelputjes die zich in de buurt van de negatieve elektrode van de elektroforese-eenheid bevinden.
Aan de andere kant bevindt zich een positieve elektrode. Een bekende standaard van DNA-fragmenten wordt in het eerste putje geplaatst dat een ladder van DNA-banden zal creëren voor vergelijkings- en identificatiedoeleinden.
De fosfaatruggengraat van DNA-moleculen geeft DNA een negatieve lading. Tegenpolen trekken elkaar aan, dus DNA-moleculen worden aangetrokken door de positieve elektrode en beginnen te bewegen, of "migreren", wanneer een elektrische stroom wordt ingeschakeld.
Kleinere DNA-fragmenten reizen sneller dan grotere fragmenten omdat ze minder weerstand ondervinden als ze door de poreuze matrix van de gel migreren. DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte vormen DNA-banden in de gel.
Kleurstof laden Doel en belang
DNA is kleurloos, dus toevoegen kleurstoffen volgen naar een voorbeeld helpt u bepaal de bewegingssnelheid van verschillende grootte eiwitmoleculen in de gel tijdens elektroforese. Voorbeelden van het laden van kleurstoffen die met het DNA-monster meebewegen zijn: broomfenolblauw en xyleen cyanol.
De gekozen kleurstof mag niet reactief zijn of het DNA veranderen. Broomfenolblauw is een kleurstof die wordt gebruikt om kleinere DNA-strengen met ongeveer 400 basenparen te volgen, terwijl xyleencyaan beter is voor grotere DNA-strengen met maximaal 8.000 basenparen. De gekozen kleurstof mag niet reactief zijn of het DNA veranderen.
De rol van glycerol in agarosegelelektroforese
Bij het klaarmaken van uw DNA-monster voor: elektroforese, moet u glycerol en water toevoegen, samen met laadkleurstoffen. Glycerol is een zware, stroperige substantie die meer dichtheid geeft aan het DNA-monster voordat het in de putjes aan het ene uiteinde van het gelvel wordt ingebracht.
Zonder glycerol zou het DNA-monster zich verspreiden in plaats van te zinken en een laag in de put te vormen, zoals het hoort om een ladder van DNA te vormen.
Tracking Dye in SDS PAGINA
Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) is een techniek die geschikt is voor het scheiden van eiwitten en aminozuren, die kleiner en complexer zijn dan lineaire DNA-moleculen. Polyacrylamide (SDS PAGE-gel) wordt gebruikt in plaats van agarosegel voor elektroforese.
Broomfenolblauw (BPB) wordt aan de monsterbuffer toegevoegd als a tracking kleurstof die zich in dezelfde richting van het scheiden van eiwitten beweegt en hun voorrand afbakent.
Rol van DNA-bindende kleurstof
DNA-bindende kleurstof zoals: oranje gekleurd ethidiumbromide kan aan de gel of aan de elektroforesebuffer worden toegevoegd. Zoals de naam al doet vermoeden, hecht de kleurstof zich aan het DNA-molecuul.
Er moet grote zorg worden besteed aan het hanteren van deze mutagene kleurstof, omdat deze zich kan binden aan DNA in huidcellen. In tegenstelling tot tracking-kleurstoffen, ethidiumbromide fluoresceert helder onder UV licht, waardoor de DNA-banden zichtbaar worden.