Biochemikai ir molekuliniai biologai naudoja elektroforezę atskirdami makromolekules, tokias kaip baltymai ir nukleorūgštys. Tai leidžia mokslininkams izoliuoti ir analizuoti atskirus baltymus ar nukleorūgščių sekas sudėtiniame mišinyje. Tipiškas elektroforezės pavyzdys laboratorijoje yra mikrobiologas, kuris naudoja polimerazės grandinės reakciją (PGR), norėdamas atskirti mikrobų bendruomenėje susidariusius DNR fragmentus. Nepaisant tikslo, elektroforezei visada reikia naudoti buferinį tirpalą.
TL; DR (per ilgai; Neskaiciau)
Elektroforezė atskiria makromolekules, tokias kaip baltymai ir nukleorūgštys, pagal dydį, krūvį ir kitas savybes. Elektroforezei, kuri išsiskiria krūviu, mokslininkai naudoja buferį, kad perduotų tą krūvį per gelį. Buferis taip pat palaiko gelio stabilų pH, sumažindamas baltymo ar nukleino rūgšties pokyčius, jei pH yra nestabilus.
Elektroforezės principai
Elektroforezė atskiria molekules pagal gradientą pagal jų dydį, krūvį ar kitas savybes. Tas gradientas gali būti elektrinis laukas arba, denatūruojančios gradiento gelio elektroforezės (DGGE) atveju, denatūrantas, pvz., Karbamido ir formamido mišinys. Baltymai migruos link anodo, jei bus neigiamai įkrautas, ir katodo, jei jis bus įkrautas teigiamai. Kadangi didesnės molekulės migruoja lėčiau nei mažesnės, mokslininkai gali išmatuoti nuvažiuotą atstumą ir naudoti logaritmus, kad nustatytų fragmentų dydį.
Denatūruojanti gradiento gelio elektroforezė
Su DGGE DNR juda didėjančios denatūruojančios galios gradientu, kol galios pakaks visiškai denatūruoti arba atsiskleisti tam tikram DNR fragmentui. Šiuo metu migracija sustoja. Mokslininkai gali naudoti šį metodą, norėdami atskirti fragmentus, atsižvelgdami į jų individualų jautrumą denatūravimui.
Ką daro buferis
Elektroforezės atveju, kuri išsiskiria pagal krūvį, buferio jonai perduoda atskyrimui reikalingą krūvį. Buferis, aprūpindamas silpnos rūgšties ir bazės rezervuarą, taip pat palaiko pH ribą. Tai svarbu, nes baltymų ar nukleorūgščių struktūra ir krūvis pasikeis, jei bus reikšmingai pakitę pH, ir taip bus išvengta tinkamo atskyrimo.
Tipiški buferiai
Skirtingi buferiai idealiai tinka palaikyti elektroforezės gelį esant skirtingiems norimiems pH intervalams. Tipiški buferiai, kuriuos mokslininkai naudoja šiam tikslui, yra acto rūgštis, boro rūgštis, fosforo rūgštis ir citrinos rūgštis, taip pat glicinas ir taurinas. Paprastai pKa vertė (rūgšties disociacijos konstanta) turėtų būti artima reikalaujamam pH. Mums geriau yra buferiai, kurie teikia mažą įkrovos dydį, kad nepraleistų per daug srovės.