羊のドリーなどの生物全体のクローンを作成することは可能ですが、DNAのクローン作成は異なります。 それは分子生物学の技術を使用して DNA配列または単一遺伝子の同一コピー.
遺伝子工学的手法を使用して、DNA遺伝暗号のセグメントが識別および分離されます。 次に、DNAクローニングは 核酸 セグメント内のシーケンス。
得られた同一のコピーは、さらなる研究またはバイオテクノロジーの応用に使用できます。 多くの場合、コピーされる遺伝子は、治療の一部を形成できるタンパク質をコードしています。 を含むDNA技術 DNAクローニング 遺伝子がどのように機能し、人間の遺伝暗号が体の機能にどのように影響するかについての理解をサポートしています。
DNAクローニング：定義とプロセスの概要
DNAクローニングは、高度な生物の遺伝暗号を含む染色体にあるDNAセグメントの同一のコピーを作成する分子生物学のプロセスです。
このプロセスでは、大量の ターゲットDNA配列. DNAクローニングの目的は、ターゲットDNA配列自体を生成すること、またはターゲット配列にコードされているタンパク質を生成することです。
DNAクローニングで使用される2つの方法は プラスミドベクター そして ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）. の中に プラスミドベクター 方法では、DNA鎖はを使用して切断されます 制限酵素 DNAフラグメントを生成し、得られたセグメントをプラスミドと呼ばれるクローニングベクターに挿入してさらに複製します。 プラスミドは細菌細胞に配置され、細菌細胞はDNAコピーまたはコードされたタンパク質を生成します。
の中に PCR法、複製されるDNA鎖のセグメントは、と呼ばれる酵素でマークされています プライマー. ポリメラーゼ酵素は、DNA鎖のマークされた部分のコピーを作成します。 この方法は制限酵素を使用せず、小さなサンプルからクローンDNAを生成できます。 2つのDNAテクノロジー手法を併用して、それぞれの最良の機能を反応全体に組み込むことがあります。
プラスミドベクター法
この方法のベクターは、クローン化される標的DNAセグメントを保持するために使用されるプラスミドを指す。 プラスミドはの小さな環状鎖です 非染色体DNA バクテリアやウイルスを含む多くの生物に見られます。
細菌プラスミドは、さらに複製するために標的DNAセグメントを細菌細胞に挿入するために使用されるベクターです。
ターゲットDNAの選択と分離： DNAクローニングプロセスを開始する前に、DNA配列、特にDNAセグメントの最初と最後を特定する必要があります。
このようなDNA配列は、既知の配列を持つ既存のクローンDNAを使用するか、ターゲットDNA配列によって生成されるタンパク質を調べることによって見つけることができます。 配列がわかれば、対応する制限酵素を使用できます。
制限酵素で標的DNAを切断する： 制限酵素は、ターゲット配列の最初と最後にあるDNAコードを探すために選択されます。
制限酵素が制限部位と呼ばれる塩基対の特別にコード化された配列を見つけると、それらは その場所でDNAに付着し、DNA分子に巻き付いて、 ストランド。 標的配列を含む切断されたDNAセグメントが複製に利用できるようになりました。
プラスミドベクターの選択とターゲットDNAの挿入： 適切なプラスミドは、理想的には、標的DNAが切り取られたDNA鎖と同じDNAコード配列を含んでいます。 プラスミドの環状DNA鎖は、標的DNAの切断に使用されたのと同じ制限酵素で切断されます。
A DNAリガーゼ酵素 DNAセグメントのリンクを促進するために使用され、ターゲットDNAセグメントの端はプラスミドDNAの切断された端とリンクします。 ターゲットDNAは環状プラスミドDNA鎖の一部を形成します。
プラスミドを細菌細胞に挿入する： プラスミドにクローン化するDNA配列が含まれると、実際のクローン化は、 細菌の形質転換. プラスミドはEなどの細菌細胞に挿入されます。 コリ、および新しいDNAセグメントを持つ細胞は、コピーと対応するタンパク質の生成を開始します。
細菌の形質転換では、宿主細胞とプラスミドを体温で約12時間一緒にインキュベートします。 細胞はいくつかのプラスミドを吸収し、それらを独自のプラスミドDNAとして扱います。
クローン化されたDNAとタンパク質の採取： DNAクローニングに使用されるほとんどのプラスミドは 抗生物質耐性遺伝子 彼らのDNAに組み込まれています。 細菌細胞が新しいプラスミドを吸収すると、抗生物質に耐性を示します。
培養物を抗生物質で処理すると、新しいプラスミドを吸収した細胞だけが生き残ります。 その結果、クローン化されたDNAを含む細菌細胞の純粋な培養が行われます。 次に、そのDNAを回収するか、対応するタンパク質を生成することができます。
PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法
ザ・ PCR 方法はより簡単で、既存のDNAを所定の位置にコピーします。 制限酵素で切断したり挿入したりする必要はありません プラスミドDNA シーケンス。 これにより、限られた数のDNA鎖を持つDNAサンプルのクローニングに特に適しています。 この方法ではDNAのクローンを作成できますが、対応するタンパク質の生産には使用できません。
DNA鎖の巻き戻し： 染色体のDNAは二重らせん構造でしっかりと巻かれています。 と呼ばれるプロセスでDNAを摂氏96度に加熱する 変性 DNA分子をほどき、2本の鎖に分離します。 一度にクローン化できるのは一本のDNAのみであるため、この分離が必要です。
プライマーの選択： プラスミドベクターDNAクローニングと同様に、クローニングされるDNA配列は、DNAセグメントの始まりと終わりに特に重点を置いて特定する必要があります。 プライマーは特定のDNAコード配列に結合する酵素であり、ターゲットDNAセグメントをマークするために選択する必要があります。 適切なプライマーがDNA分子配列に結合して、ターゲットセグメントの開始と終了をマークします。
プライマーを結合するための反応のアニーリング： 反応を摂氏約55度まで冷却することを呼びます アニーリング. 反応が冷えると、プライマーが活性化され、ターゲットDNAセグメントの両端のDNA鎖に付着します。 プライマーはマーカーとしてのみ機能し、DNA鎖を切断する必要はありません。
ターゲットDNAセグメントの同一コピーの作成： と呼ばれるプロセスで 拡張、感熱性TAQポリメラーゼ酵素が反応に追加されます。 次に、反応物を摂氏72度に加熱し、酵素を活性化します。 活性DNAポリメラーゼ酵素はプライマーに結合し、それらの間でDNA配列をコピーします。 最初のDNAシーケンシングおよびクローニングプロセスが完了しました。
クローン化されたDNAの収量の増加： 最初のアニーリングおよび伸長プロセスでは、利用可能なDNA鎖セグメントのコピーが比較的少なくなります。 追加のDNA複製によって収量を増やすには、反応を再度冷却してプライマーを再活性化し、他のDNA鎖に結合させます。
次に、反応を再加熱すると、ポリメラーゼ酵素が再び活性化され、より多くのコピーが生成されます。 このサイクルは25〜30回繰り返すことができます。
プラスミドベクターとPCRDNAクローニング法を併用する
プラスミドベクター法は、プラスミドを切断して挿入するために、DNAの十分な初期供給に依存しています。 元のDNAが少なすぎると、プラスミドが少なくなり、クローンDNAの生成が遅くなります。
PCR法では、数本の元のDNA鎖から大量のDNAを生成できますが、細菌細胞にDNAが埋め込まれていないため、タンパク質を生成することはできません。
小さな初期DNAサンプルからクローン化されるDNAフラグメントにコードされたタンパク質を生成するには、2つの方法を一緒に使用できます。 それぞれを補完しあう。 まず、PCR法を使用して、小さなサンプルからDNAをクローン化し、多数のコピーを作成します。
次に、PCR産物をプラスミドベクター法とともに使用して、生成されたDNAを細菌細胞に移植します。細菌細胞は目的のタンパク質を生成します。
バイオテクノロジーのためのDNAクローニングの例
分子生物学は、医療および商業目的で遺伝子クローニングとDNA複製を使用します。 DNA配列がクローン化されたバクテリアは、薬を生産し、遺伝性疾患を持つ人々が自分で生産できない物質を置き換えるために使用されます。
典型的な用途は次のとおりです。
- の遺伝子 ヒトインスリン は細菌にクローン化され、糖尿病患者が使用するインスリンを産生します。
- 組織プラスミノーゲン活性化因子は、クローン化されたDNAから生成され、 血栓を防ぐ.
- 人間の成長ホルモン 自分で作ることができない人に作って投与することができます。
バイオテクノロジーはまた、農業で遺伝子クローニングを使用して、植物や動物に新しい特性を作成したり、既存の特性を強化したりします。 より多くの遺伝子がクローン化されるにつれて、可能な使用の数は指数関数的に増加します。
研究のためのDNAクローニングの例
DNA分子は生細胞内の物質のごく一部を構成しており、多くの遺伝子の影響を分離することは困難です。 DNAクローニング法は、研究用の特定のDNA配列を大量に提供し、DNAは元の細胞と同じようにタンパク質を生成します。 DNAクローニングにより、さまざまな遺伝子についてこの操作を分離して研究することができます。
典型的な研究およびDNA技術のアプリケーションには、以下の調査が含まれます。
- 遺伝子の機能。
- 遺伝子の突然変異。
- 遺伝子発現。
- 遺伝子産物。
- 遺伝的欠陥。
より多くのDNA配列がクローン化されると、追加の配列を見つけてクローン化するのが簡単になります。 既存のクローン化されたDNAセグメントを使用して、新しいセグメントが古いセグメントと一致するかどうか、およびどの部分が異なるかを判断できます。 その場合、標的DNA配列の特定は、より速く、より正確になります。
遺伝子治療のためのDNAクローニングの例
に 遺伝子治療、クローン化された遺伝子は、天然の遺伝子が損傷を受けている生物の細胞に提示されます。 特定の生物の機能に必要なタンパク質を産生する重要な遺伝子は、突然変異したり、放射線によって変化したり、ウイルスの影響を受けたりする可能性があります。
遺伝子が正常に機能しない場合、重要な物質が細胞から失われます。 遺伝子治療は 遺伝子を、必要な物質を生成するクローンバージョンに置き換えます.
遺伝子治療はまだ実験的であり、この技術を使用して治癒した患者はほとんどいません。 問題は、病状の原因となる単一の遺伝子を特定し、その遺伝子の多くのコピーを適切な細胞に送達することにあります。 DNAクローニングが普及するにつれ、遺伝子治療はいくつかの特定の状況で適用されてきました。
最近成功したアプリケーションは次のとおりです。
- パーキンソン病： ウイルスをベクターとして使用して、パーキンソン病関連遺伝子を患者の中脳に注入しました。 患者は、有害な副作用なしに運動技能の改善を経験しました。
- アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症： 遺伝性免疫障害は、患者の血液幹細胞を取り除き、ADA遺伝子を挿入することによって治療されました。 その結果、患者は自分のADAの少なくとも一部を作成することができました。
- 血友病： 血友病の人は、血栓を助ける特定のタンパク質を産生しません。 不足しているタンパク質の1つを生成するための遺伝子が患者の肝細胞に挿入されました。 患者はタンパク質を産生し、出血の発生は減少しました。
遺伝子治療は、DNAクローニングの最も有望なアプリケーションの1つですが、より多くのDNA配列が研究され、それらの機能が決定されるにつれて、他の新しい用途が急増する可能性があります。 DNAクローニングは、遺伝子工学の原料を必要な量で提供します。
遺伝子の役割がわかっていて、欠陥のあるものを交換することで適切な機能を確保できる場合 遺伝子、多くの慢性疾患、さらには癌でさえ、DNAを使用して遺伝子レベルで攻撃および治療することができます 技術。
関連性のあるコンテンツ：
- E.Coli（Escherichia Coli）のコロニー特性
- RNA：定義、機能、構造