ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、溶液中のタンパク質を同定する生化学的方法です。 Mathews et alの「生化学」で説明されているように、タンパク質サンプルは最初にポリアクリルアミドゲルブロックの一端の「ウェル」または穴にロードされます。 次に、電界がゲルに適用されます。 ロードされたサンプルに追加されたSDSは、タンパク質の自然電荷を打ち消します。 このため、タンパク質の分子量だけで、タンパク質がゲルを通って正に帯電した極に向かって移動するときのタンパク質の移動速度が決まります、とBitesizeBioは述べています。 したがって、同じサンプル内の複数のタンパク質は互いに分離し、異なる位置に移動します。
ゲル写真の向きを変えます。 「上」は、サンプルが最初に追加されたウェルの場所です。 「下部」は、サンプルが移動する場所であり、ほとんどの場合、サンプルの移動する前面を示す色素前面が含まれています。 左または右のいずれかに、予測可能な分子量ガイドとして使用される「マーカー」が含まれている必要があります。
各レーンのサンプルにラベルを付けます。 上部を横切って、ウェルに追加されたサンプルは「レーン」で垂直に移動します。 したがって、垂直の列に表示されるすべてのバーは、その真上にロードされた1つのサンプルからのものです。 列を視覚化するのが難しい場合は、定規とペンを使用してレーンに境界線を配置します。
マーカーレーンのバンドの分子サイズにラベルを付けます。 市販のマーカーには、各バンドの分子量とともに予想されるバンドパターンの写真が付属しています。 バンドは暗い水平の「バー」であり、実際にはゲルに埋め込まれた染色されたタンパク質です。
各マーカーバンドからゲルの反対側の端まで伸びる明るい水平線を引きます。 これらの線をウェルと色素前面に平行にするように注意してください。 これらの線は、各マーカーバンドによって示される分子量のタンパク質が各レーンのどこに配置されるかを示しています。 たとえば、25キロダルトンから伸びる線のすぐ下にあるレーン4のバンド マーカーバンドは、レーン4のバンドの分子量が25キロダルトンに近いことを示唆しています。 重量。
各レーンの各バンドに、推定分子量のラベルを付けます。 マーカーをガイドとして使用し、マーカーサイズ間の値を推定します。
ゲル写真の下に、各レーンの「タンパク質」のリストを作成します。 起源や条件など、各サンプルについて知られていることを述べることから始めます。 次に、レーン内の各バンドの推定分子量をリストします。 1つのバンドのあるレーンは、サンプルに含まれるタンパク質が1つだけであることを示しています。 複数のバンドのあるレーンは、複数のタンパク質の存在を示しています。 移行フロントで実行されるバンドは、最も近いマーカーによって提案されたものよりも小さく、マーカーが示す「より小さい」場合を除いて予測できない可能性があります。
タンパク質リストで、奇妙なことに注意してください。 「にじんだ」外観は、タンパク質が多すぎるか、サンプルの粘度がその移動に影響を与えたことを示している可能性があります。 レーンの端または他のバンドと比較して非常に大きい場合、そのタンパク質の濃度が高すぎる可能性があり、将来的に希釈する必要があります 電気泳動。 レーン全体の灰色がかった色合いは、背景のゲルの色よりも暗く、区別できないタンパク質フラグメントを示しています。
各レーンのタンパク質の同一性を決定します。 これは分子量のみを使用して行われますが、各レーンのソースも手がかりを示している可能性があります。 ある条件下では、タンパク質がゲル上で二量体または三量体の会合を維持できることを考慮してください。 したがって、1つのタンパク質が3つの異なるバンドとしてゲル上に現れる場合があります。 タンパク質を特定できない場合でも、バンドの相対的な暗さは、溶液中のタンパク質の濃度を示している可能性があります。 好奇心が強く未知のタンパク質は、元のゲルから直接分離して、同定のために送ることができます。
必要なもの
- 染色したSDS-PAGEゲルの写真
- 使用する分子量マーカーのキー
- ルーラー
- ペン