Elettroforesi su gel è una tecnica di laboratorio comunemente usata con molte applicazioni pratiche tra cui il fingerprinting del DNA e il sequenziamento del genoma. Il processo prevede la separazione DNA frammenti utilizzando una corrente elettrica durante il monitoraggio della velocità di movimento molecolare attraverso un gel filtrante.
L'aggiunta di colorante di tracciamento blu o arancione a campioni di DNA incolore consente di vedere il campione e ottenere informazioni su come le molecole di DNA si muovono durante l'elettroforesi. L'identificazione si basa sulla dimensione delle bande di DNA sul gel dopo la migrazione delle molecole.
Come funziona l'elettroforesi su gel
Elettroforesi su gel tira i frammenti di DNA attraverso un gel usando una corrente elettrica per isolare e identificare le molecole di DNA per dimensione e carica elettrica. Il gel è spesso realizzato con agarosio in polvere — un polisaccaride estratto da alga marina.
L'agarosio viene aggiunto a una soluzione tampone di acqua e sale e la miscela viene riscaldata e raffreddata per formare un gel poroso che fungerà da matrice filtrante durante la procedura di elettroforesi. Il gel viene quindi posto in un'unità di elettroforesi e coperto con una soluzione tampone che conduce
elettricità.Le soluzioni contenenti DNA e coloranti di caricamento vengono pipettate in piccoli pozzetti nel gel che devono essere preparati durante la preparazione del gel. colorantiAiutartivedere chiaramente il campione che si sta aggiungendo ai pozzetti del gel situati vicino all'elettrodo negativo dell'unità di elettroforesi.
Un elettrodo positivo si trova all'estremità opposta. Nel primo pozzetto viene posizionato uno standard noto di frammenti di DNA che creerà una scala di bande di DNA a scopo di confronto e identificazione.
La spina dorsale di fosfato delle molecole di DNA conferisce al DNA una carica negativa. Gli opposti si attraggono quindi, di conseguenza, le molecole di DNA sono attratte dall'elettrodo positivo e iniziano a muoversi, o "migrare", quando viene attivata una corrente elettrica.
I frammenti di DNA di dimensioni più piccole viaggiano più velocemente dei frammenti più grandi perché incontrano meno resistenza mentre migrano attraverso la matrice porosa del gel. Frammenti di DNA di dimensioni simili formano bande di DNA nel gel.
Caricamento del colorante Scopo e importanza
Il DNA è incolore, quindi aggiungendo coloranti di tracciamento ad un campione ti aiuta determinare la velocità di movimento di molecole proteiche di diverse dimensioni nel gel durante l'elettroforesi. Esempi di coloranti di caricamento che si muovono con il campione di DNA includono bromofenoloblu e xilene cianolo.
Il colorante scelto non deve essere reattivo o alterare il DNA. Il blu di bromofenolo è un colorante utilizzato per tracciare filamenti di DNA di dimensioni più piccole contenenti circa 400 paia di basi, mentre lo xilene cianolo è migliore per filamenti di DNA più grandi con un massimo di 8.000 paia di basi. Il colorante scelto non deve essere reattivo o alterare il DNA.
Ruolo del glicerolo nell'elettroforesi su gel di agarosio
Quando prepari il tuo campione di DNA per elettroforesi, sarà necessario aggiungere glicerolo e acqua insieme al caricamento dei coloranti. Il glicerolo è una sostanza pesante e sciropposa che conferisce maggiore densità al campione di DNA prima che venga inserito nei pozzetti a un'estremità del foglio di gel.
Senza glicerolo, il campione di DNA si disperderebbe invece di affondare e formare uno strato nel pozzo come dovrebbe fare per formare una scala di DNA.
Tracking Dye nella PAGINA SDS
L'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS PAGE) è una tecnica adatta per separare proteine e amminoacidi, che sono più piccoli e più complessi delle molecole di DNA lineare. La poliacrilammide (gel SDS PAGE) viene utilizzata al posto del gel di agarosio per l'elettroforesi.
Il blu di bromofenolo (BPB) viene aggiunto al tampone del campione come a tracciante colorante che si muove nella stessa direzione di separazione delle proteine e ne delimita il bordo d'attacco.
Ruolo del colorante che lega il DNA
colorante che lega il DNA come di colore arancione il bromuro di etidio può essere aggiunto al gel o al tampone per elettroforesi. Come suggerisce il nome, il colorante si attacca alla molecola del DNA.
È necessario prestare molta attenzione quando si maneggia questo colorante mutageno perché può legarsi al DNA nelle cellule della pelle. A differenza dei coloranti traccianti, il bromuro di etidio fluorescenti brillantemente sotto luce UV, rendendo visibili le bande del DNA.