Što je smrzavajuće lomljenje i zašto je korisno u biologiji stanica?

Stanične membrane sastoje se od fosfolipida i vezanih ili ugrađenih proteina. Proteini membrane igraju vitalnu ulogu u metabolizmu i životu stanice. Ne možete koristiti uobičajenu mikroskopiju za vizualizaciju ili karakterizaciju adhezijskih proteina, transport proteina i proteinskih kanala u staničnoj membrani. Korištenjem elektronske mikroskopije i tehnike koja se naziva "smrznuti prijelom", koja razdvaja zamrznute stanične membrane, omogućuje vizualizaciju membranske strukture i organizaciju proteina u moru fosfolipidi. Kombinacija drugih metoda s smrzavajućim lomljenjem ne samo da nam pomaže razumjeti strukturu različitih staničnih membrana i membranskih proteina, ali omogućuje vizualizaciju i detaljnu analizu funkcije specifičnih proteina, bakterija i virusi.

Koristeći tekući dušik, uzorci ili stanice biološkog tkiva brzo se zamrzavaju kako bi imobilizirali sastojke stanica. Stanične membrane sastoje se od dva sloja fosfolipida, koja se nazivaju dvosloj, gdje hidrofobni ili mrzeći vodu lipidni repovi pokazuju na unutarnja strana membrane i hidrofilni, odnosno voljeći krajevi molekule lipida usmjereni su prema van i prema unutrašnjosti stanica. Smrznuti uzorak napuknut je ili slomljen mikrotomom, koji je instrument poput noža za rezanje tankih kriški tkiva. Zbog toga se stanična membrana točno razdvaja između dva sloja, jer privlačnost između hidrofobnih lipidnih repova predstavlja najslabiju točku. Nakon lomljenja, uzorak se podvrgava vakuumskom postupku, koji se naziva "zamrzavanje nagrizanjem". Površina loma uzorak je zasjenjen parom ugljika i platine kako bi se dobila stabilna replika koja prati konture loma avion. Kiselina se koristi za probavljanje organskog materijala koji se lijepi za repliku, ostavljajući tanku platinastu ljusku frakturirane površine membrane. Zatim se ova ljuska analizira elektronskom mikroskopijom.

Zamrzavanje jetkanje je vakuumsko sušenje nečvrstog, smrznutog i smrznutog loma biološkog uzorka. Postupak vakuumskog sušenja sličan je smrzavanju voća i povrća koje se pakira i prodaje u trgovinama. Bez zamrzavanja, mnogi detalji stanične strukture zastiru se kristalima leda. Korak dubokog ili zamrzavanja poboljšava i proširuje izvornu metodu loma smrzavanjem, omogućujući promatranje staničnih membrana tijekom različitih aktivnosti. Omogućuje analizu ne samo strukture membrane, već i unutarćelijskih komponenata i pruža detaljne strukturne informacije o bakterijama, virusima i velikim staničnim proteinima kompleksi.

Elektronska mikroskopija može otkriti i povećati više od milijun puta najsitnijih organizama ili struktura, poput bakterija, virusa, unutarstaničnih komponenata, pa čak i bjelančevina. Vizualizacija se stvara bombardiranjem ultra tankog uzorka snopom elektrona. Dvije metode elektronske mikroskopije su skenirajuća elektronska mikroskopija ili SEM i prijenosna elektronska mikroskopija ili TEM. Uzorci smrznutih lomova rutinski se analiziraju s TEM. TEM ima bolju razlučivost od SEM-a i nudi strukturne informacije do 3 nanometara replika.

Razvoj i primjena elektronskog mikroskopa smrzavajućeg loma pokazali su da su stanične plazmene membrane sačinjene od lipidnih dvoslojnih slojeva i razjasnili su kako su proteini organizirani unutar staničnih membrana. Zamrzani lom daje jedinstveni pogled na unutrašnjost staničnih membrana, jer se cijepa i razdvaja membranske fosfolipide u dva suprotna i komplementarna sloja ili površine. U više od 50 godina od uvođenja prvog stroja za smrzavanje, izrada replike platine i dalje je jedini način za dobivanje strukturnih podataka o staničnoj membrani. Tehnika pokazuje plutaju li određeni proteini ili su usidreni u staničnoj membrani te agregiraju li se i kako neki proteini. Novija metoda - upotreba antitijela koja ciljaju specifične proteine ​​- kombinira se sa smrzavajućim prijelomom kako bi se identificirali proteini i njihova funkcija u staničnoj membrani.