Western blot, analitička tehnika koja se koristi za određivanje određenog proteina u danom uzorku, koristi sposobnost enzima ili fluorescentno obilježenog primarnog protutijela da se veže na svoj specifični antigen. To je postupak u tri koraka koji započinje gelskom elektroforezom, nakon čega slijedi blotiranje membrane i sondiranje antitijelima. Otkrivanje proteina može biti izravno ili neizravno, s tim da se potonje koristi obilježenim sekundarnim antitijelima usmjerenim protiv primarnog. Iako je prihvaćen kao rutinska tehnika analize proteina, Western blot ima ograničenja kao i prednosti.
Prednost: Osjetljivost
Jedan od najvećih argumenata u korist western blota je njegova osjetljivost. Zbog svoje sposobnosti otkrivanja samo 0,1 nanograma proteina u uzorku, tehnika teoretski može poslužiti kao učinkovit alat za ranu dijagnostiku, koji otkriva i najmanji imunogeni odgovor virusa ili bakterije kod pacijenta uzorak. Neizravni Western blot nadalje nadovezuje na ovu osjetljivost iz sposobnosti sekundarnog antitijela da pojača intenzitet signala koji detektira sustav za snimanje. Veća osjetljivost znači da je za ispitivanje potrebno manje antitijela, što značajno smanjuje laboratorijske troškove.
Prednost: Specifičnost
Western blot tehnika svoju specifičnost duguje dvama značajnim čimbenicima. Prvo, gel elektroforeza sortira uzorak na proteine različite veličine, naboja i konformacije. Taj je postupak sam po sebi ogroman korak ka otkrivanju, jer trake stvorene u gelu već daju naznake o veličini proteina ili polipeptida od interesa. Specifičnost interakcije antitijelo-antigen služi kao drugi veliki faktor. Budući da specifična antitijela pokazuju afinitet prema specifičnim proteinima, postupak može selektivno detektirati ciljni protein čak i u smjesi od 300 000 različitih proteina.
Nedostatak: sklon lažnim ili subjektivnim rezultatima
Unatoč svojoj osjetljivosti i specifičnosti, vestern mrlja i dalje može donijeti pogrešne rezultate. Lažno pozitivni rezultati kada antitijelo reagira s bjelančevinama koje nisu namijenjene, što je često događa se kada pacijent koji se testira na HIV ima tuberkulozu ili niz parazita infekcije. S druge strane, lažno negativni mogu lako nastati ako se većim proteinima ne da dovoljno vremena da se pravilno prenesu na membranu. Nepravilno upijanje i obrada često proizvode iskrivljene, izblijedjele ili čak višestruke vrpce, što rezultate ispitivanja podvrgava tumačenju tehničara.
Nedostatak: visoka cijena i tehnička potražnja
Trošak Western blot-a sastavljen je od velikih pojedinačnih izdataka za označena antitijela, vješte analitičare i laboratorijsku opremu. Nježan postupak, Western blot zahtijeva preciznost u svakom koraku za pravilnu identifikaciju sastojaka uzorka. Mala pogreška u koncentraciji reagensa ili u razdoblju inkubacije može biti pogubna za cijeli postupak. Napokon, oprema potrebna za otkrivanje i slikanje - kemiluminescentni, fluorescentni, radioaktivni ili laserski sustavi za otkrivanje - može biti preskupa za prosječnu mikrobiološku jedinicu.