Les chimistes utilisent la chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, pour séparer les mélanges de composés. En général, la méthode consiste à injecter un échantillon dans une colonne où il se mélange avec un ou plusieurs solvants. Différents composés s'adsorbent ou « adhèrent » à la colonne à des degrés différents; et lorsque le solvant pousse les composés à travers la colonne, l'un des composants du mélange sortira en premier de la colonne. L'instrument détecte les composés à leur sortie de la colonne et produit un chromatogramme qui consiste en un tracé avec le temps de rétention sur l'axe des x et l'intensité du signal du détecteur sur l'axe des y. Lorsque les composés sortent de la colonne, ils produisent des « pics » dans le chromatogramme. En général, plus les pics du chromatogramme sont éloignés et étroits, plus la résolution est élevée. Les scientifiques considèrent qu'une résolution de 1,0 ou plus représente une séparation adéquate.
Mesurez les largeurs de deux pics adjacents dans le chromatogramme en notant où se trouvent les valeurs de l'axe des x à la base de chaque pic. L'axe des x représente le temps de rétention, généralement mesuré en secondes. Ainsi, si un pic commence à 15,1 secondes et se termine à 18,5 secondes, sa largeur est (18,5 - 15,1) = 3,4 secondes.
Déterminer les temps de rétention en notant le temps, c'est-à-dire l'emplacement sur l'axe des x, qui correspond aux emplacements des maxima des pics. Cette valeur sera normalement environ à mi-chemin entre les deux valeurs utilisées pour calculer la largeur à l'étape 1. L'exemple donné à l'étape 1, par exemple, présenterait un maximum à environ 16,8 secondes.
Calculez la résolution, R, entre deux pics en :
R=\frac{RT_1-RT_2}{0.5(W_1+W_2)}
où RT1 et RT2 représentent les temps de rétention des pics 1 et 2, et W1 et W2 représentent les largeurs des pics prises à leurs bases. Poursuivant l'exemple des étapes 2 et 3, un pic présente un temps de rétention de 16,8 secondes et une largeur de 3,4 secondes. Si le deuxième pic présentait un temps de rétention de 21,4 secondes avec une largeur de 3,6 secondes, alors la résolution serait :
R=\frac{21,4-16,8}{0,5(3,4+3,6)}=1,3
Choses dont vous aurez besoin
- Chromatogramme HPLC
- Calculatrice