Électrophorèse sur gel est une technique de laboratoire couramment utilisée avec de nombreuses applications pratiques, notamment les empreintes génétiques et le séquençage du génome. Le processus consiste à séparer ADN fragments à l'aide d'un courant électrique tout en suivant le taux de mouvement moléculaire à travers un gel filtrant.
L'ajout d'un colorant de suivi bleu ou orange à des échantillons d'ADN incolores vous permet de voir votre échantillon et d'obtenir des informations sur la façon dont les molécules d'ADN se déplacent pendant l'électrophorèse. L'identification est basée sur la taille des bandes d'ADN sur le gel après migration des molécules.
Comment fonctionne l'électrophorèse sur gel
Électrophorèse sur gel tire des fragments d'ADN à travers un gel en utilisant un courant électrique pour isoler et identifier les molécules d'ADN par taille et charge électrique. Le gel est souvent fait avec poudre d'agarose — un polysaccharide extrait de algue.
L'agarose est ajouté à une solution tampon d'eau et de sel, et le mélange est chauffé et refroidi pour former un gel poreux qui servira de matrice filtrante pendant la procédure d'électrophorèse. Le gel est ensuite placé dans une unité d'électrophorèse et recouvert d'une solution tampon qui conduit
électricité.Les solutions contenant de l'ADN et des colorants de charge sont pipetées dans de petits puits dans le gel qui doivent être réalisés pendant la préparation du gel. TeinturesT'aidervoir clairement l'échantillon que vous ajoutez aux puits de gel situés près de l'électrode négative de l'unité d'électrophorèse.
Une électrode positive est située à l'extrémité opposée. Un standard connu de fragments d'ADN est placé dans le premier puits qui créera une échelle de bandes d'ADN à des fins de comparaison et d'identification.
Le squelette phosphate des molécules d'ADN donne à l'ADN une charge négative. Les opposés s'attirent, par conséquent, les molécules d'ADN sont attirées par l'électrode positive et commencent à se déplacer, ou « migrer », lorsqu'un courant électrique est activé.
Les fragments d'ADN de plus petite taille voyagent plus rapidement que les fragments plus gros car ils rencontrent moins de résistance lorsqu'ils migrent à travers la matrice poreuse du gel. Des fragments d'ADN de taille similaire forment des bandes d'ADN dans le gel.
Chargement du colorant Objectif et importance
L'ADN est incolore, donc en ajoutant colorants de suivi à un échantillon vous aide déterminer la vitesse de déplacement de molécules de protéines de tailles différentes dans le gel pendant l'électrophorèse. Des exemples de colorants de chargement qui se déplacent avec l'échantillon d'ADN comprennent bromophénolbleu et xylène cyanol.
Le colorant choisi ne doit pas être réactif ni altérer l'ADN. Le bleu de bromophénol est un colorant utilisé pour suivre les brins d'ADN de plus petite taille contenant environ 400 paires de bases, tandis que le xylène cyanol est meilleur pour les brins d'ADN plus gros avec jusqu'à 8 000 paires de bases. Le colorant choisi ne doit pas être réactif ni altérer l'ADN.
Rôle du glycérol dans l'électrophorèse sur gel d'agarose
Lorsque vous préparez votre échantillon d'ADN pour électrophorèse, vous devrez ajouter du glycérol et de l'eau ainsi que des colorants de chargement. Le glycérol est une substance lourde et sirupeuse qui donne plus de densité à l'échantillon d'ADN avant qu'il ne soit inséré dans les puits à une extrémité de la feuille de gel.
Sans glycérol, l'échantillon d'ADN se disperserait au lieu de couler et de former une couche dans le puits comme il est censé le faire pour former une échelle d'ADN.
Suivi du colorant dans la PAGE SDS
L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide dodécyl sulfate de sodium (SDS PAGE) est une technique appropriée pour séparer les protéines et les acides aminés, qui sont plus petits et plus complexes que les molécules d'ADN linéaires. Le polyacrylamide (gel SDS PAGE) est utilisé à la place du gel d'agarose pour l'électrophorèse.
Le bleu de bromophénol (BPB) est ajouté au tampon d'échantillon comme colorant de suivi qui se déplace dans le même sens de séparation des protéines et délimite leur bord d'attaque.
Rôle du colorant liant l'ADN
colorant liant l'ADN tel que couleur orange le bromure d'éthidium peut être ajouté au gel ou au tampon d'électrophorèse. Comme son nom l'indique, le colorant se fixe à la molécule d'ADN.
Un grand soin doit être pris lors de la manipulation de ce colorant mutagène car il peut se lier à l'ADN dans les cellules de la peau. Contrairement aux colorants de suivi, le bromure d'éthidium fluorescent brillamment sous lumière UV, rendant les bandes d'ADN visibles.