Le plan génétique d'une cellule est codé dans son matériel génétique, ou ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, pour que cette information pénètre dans le cytoplasme où d'autres protéines et composants biochimiques résident, il faut d'abord transcrire l'ADN en ARN messager (ARNm ou poly (A) ARN). Cet ARNm est ensuite traduit en protéines qui remplissent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou quantifier des ARNm très rares, fabriquer des sondes pour les puces à ADN ou construire des bibliothèques de molécules d'ADN complémentaires, l'ARNm doit être isolé. Cependant, l'extraction de l'ARN total (c'est-à-dire tout l'ARN dans une cellule) et l'isolement de l'ARNm ultérieur ne sont pas des processus qui s'excluent mutuellement; le premier doit être effectué pour que l'ARNm soit extrait.
Homogénéisation TRIzol: l'ARN total comprend tous les ARNm, ARN de transfert, ARN ribosomique et autres non codants ARN. Pour les séparer des autres composants cellulaires, la cellule est d'abord ouverte pour libérer son Contenu. Cela se fait en remettant en suspension les cellules agglomérées par centrifugation (tournant à grande vitesse) dans le réactif TRIzol (Life Technologies). D'autres versions de TRIzol (telles que le réactif TRI d'Ambion) fonctionnent de manière similaire.
Isolement de l'ARN total: une série de centrifugations est utilisée pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule en couches ou phases au sein de la suspension. La phase supérieure, de couleur jaune, est composée de graisse et peut être jetée. La phase désirée est teintée en rouge, contient l'ARN total et est retenue. Après avoir effectué une extraction au phénol-chloroforme et une série de lavages à l'alcool à l'aide d'isopropanol et d'éthanol, l'ARN peut être sédimenté pour l'isolement de l'ARNm. Ajouter des inhibiteurs de RNase pour empêcher cette enzyme de dégrader l'ARN total.
Extraction d'ARNm: il est courant d'utiliser un kit pour isoler les ARNm, car les protocoles de laboratoire faits maison ne génèrent pas de grandes quantités d'ARNm hautement purifiés. Les kits commerciaux incluent FastTrack 2.0 d'Invitrogen ou l'isolement d'ARNm Poly (A)Pure d'Ambion Trousse. Ces étapes de base sont communes à ces kits :
d) Centrifuger cet échantillon et récupérer le surnageant, qui est lavé plusieurs fois dans une série de tampons liants et pauvres en sel fournis dans les kits.
Les références
- « Protocoles de bibliothèque d'ADNc? »; Ian G. Cowell et Caroline A. Austin; 1997
- « Protocoles de transcription et de traduction in vitro? »; Martin J. Tymms; 1995
Conseils
- Gardez tous les réactifs, les cellules et l'ARN au froid en les immergeant dans la glace. Cela empêche l'ARN d'être dégradé par d'autres enzymes libérées au cours du processus d'homogénéisation.
Mises en garde
- Les réactifs tels que le TRIzol sont toxiques et ne doivent pas être en contact avec la peau ou les muqueuses. Respectez toujours les protocoles de laboratoire sûrs lors de la manipulation de ce réactif.
A propos de l'auteur
Palmer Owyoung est titulaire d'une maîtrise ès arts en commerce international de l'Université de Californie à San Diego et d'un Baccalauréat ès arts en sociologie de l'Université de Californie à Santa Barbara et est un moléculaire formé biologiste. Il est écrivain indépendant depuis 2006. En plus d'écrire, il est un trader Forex et un spécialiste du marketing Internet à temps plein.
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