La spectrophotométrie est un outil précieux en chimie et en biologie. L'idée de base est simple: différentes substances absorbent mieux la lumière/le rayonnement électromagnétique à certaines longueurs d'onde qu'à d'autres. C'est pourquoi certains matériaux sont transparents tandis que d'autres sont colorés, par exemple. Lorsque vous faites passer une lumière d'une longueur d'onde donnée à travers une solution, plus sa concentration est élevée, plus elle absorbera de lumière. Pour calculer la concentration, vous devez comparer votre lecture avec les lectures d'étalons de concentration connue. La procédure ci-dessous est une procédure assez générique écrite en pensant à un laboratoire d'enseignement de la chimie, mais elle peut également être modifiée pour d'autres paramètres.
Comme toujours lorsque vous travaillez dans un laboratoire, mettez vos lunettes, vos gants et votre manteau à manches longues pour assurer votre propre sécurité.
Pressez la poire en caoutchouc pour la vider d'air, puis placez-la sur votre pipette graduée et laissez la poire se détendre pour qu'elle aspire l'eau dans la pipette. Ensuite, retirez l'ampoule et bouchez le haut de la pipette avec votre doigt; cela scellera la pipette afin que la solution à l'intérieur ne s'écoule pas jusqu'à ce que votre doigt soit retiré. Soulevez légèrement le bord de votre doigt pour laisser un peu de solution s'écouler de la pipette, jusqu'à ce que vous atteigniez le volume souhaité. Entraînez-vous avec de l'eau et un bécher pour avoir une idée du fonctionnement de la pipette graduée. Le lien sous la section Ressources contient un clip vidéo pour vous montrer comment utiliser une pipette au cas où vous n'en auriez jamais travaillé auparavant.
Étiqueter 5 tubes à essai selon les normes 1-5. Vous pouvez les étiqueter en utilisant du ruban adhésif et un stylo ou en utilisant un marqueur effaçable à sec.
Choisissez cinq concentrations pour vos étalons. Vous voulez que les concentrations standard soient séparées les unes des autres d'environ le même intervalle - par exemple, 0,1 molaire, 0,2 molaire, 0,3 molaire, etc. - et à peu près dans la même fourchette que ce que vous attendez de votre inconnu. Pour le moment, utilisez les cinq concentrations suivantes, mais n'oubliez pas que vous devrez les modifier lors de votre propre expérience :
Standard 1: 0,1 molaire Standard 2: 0,2 molaire Standard 3: 0,3 molaire Standard 4: 0,4 molaire Standard 5: 0,5 molaire
Ensuite, prenez la solution étalon 1 molaire et ajoutez les quantités suivantes aux tubes à essai 1-5. N'oubliez pas que ces quantités sont calculées à l'aide des concentrations répertoriées ci-dessus, vous devrez donc peut-être les modifier si nécessaire lorsque vous effectuez votre propre expérience.
Standard 1: 0,8 millilitres Standard 2: 1,6 millilitres Standard 3: 2,4 millilitres Standard 4: 3,2 millilitres Standard 5: 4 millilitres
Rincer la pipette graduée, puis transférer les quantités suivantes d'eau déminéralisée :
Standard 1: 7,2 millilitres Standard 2: 6,4 millilitres Standard 3: 5,6 millilitres Standard 4: 4,8 millilitres Standard 5: 4,0 millilitres
Fondamentalement, l'idée est d'amener la quantité de solution dans chaque tube jusqu'à 8 millilitres.
Boucher chacun des tubes standards avec du parafilm et les retourner pour mélanger.
Marquez cinq autres tubes à essai comme "Inconnu 1-5". Ajoutez les mêmes quantités de votre solution inconnue ou de test à chacun que vous avez utilisé avec la solution 1 molaire pour les normes. En d'autres termes, l'inconnu 1 contiendra 0,8 millilitre de solution d'essai et 7,2 millilitres de l'eau, inconnu 2 contiendra 1,6 millilitres de solution d'essai et 6,4 millilitres d'eau, et ainsi en avant.
Coiffez chacune des inconnues avec du parafilm et retournez soigneusement pour mélanger.
Allumez le spectrophotomètre et laissez-le se réchauffer. La durée nécessaire dépendra du modèle et du fabricant.
Réglez la longueur d'onde sur le spectrophotomètre. La longueur d'onde dépendra du type de produit chimique dans votre expérience. Pour l'instant, supposons 500 nm, mais rappelez-vous que vous devrez changer cela pour différentes expériences.
Calibrez votre spectrophotomètre. La procédure d'étalonnage varie en fonction de l'appareil que vous utilisez. Pour le Spectronic 20, un modèle courant dans les laboratoires d'enseignement, vous ajusterez d'abord la machine pour qu'elle indique "0 pour cent T" lorsqu'aucune cuvette n'est chargée, puis ajustez-la pour qu'elle indique « 100 % T » lorsqu'une cuvette vierge contenant uniquement de l'eau déminéralisée est chargé. Ces procédures peuvent varier en fonction du type de machine que vous utilisez, consultez donc les instructions du fabricant pour plus de détails.
Une fois la machine calibrée, prenez le tube à essai standard 1 et versez le contenu dans une cuve propre jusqu'à ce qu'il atteigne la ligne de remplissage. Essuyez la cuvette avec un kimwipe pour éliminer toute trace de doigt ou autre saleté. Insérez la cuvette dans le spectrophotomètre et enregistrez la lecture "%T".
Répétez cette procédure pour les 10 échantillons. SOYEZ CERTAIN de nettoyer la cuvette entre les échantillons pour vous assurer que vos résultats sont aussi précis que possible.
Prenez les résultats pour vos normes et entrez-les dans un tableur/programme graphique comme Excel ou OpenOffice.
À l'aide du tableur, divisez 100 pour cent par chacune des valeurs « %T » pour les normes, puis prenez le journal du résultat. Ce calcul vous donnera l'absorbance. Si vous saisissez la formule, votre tableur effectuera le calcul pour vous.
Exemple: si le %T est 50,6, la formule que vous saisissez dans le tableur serait la suivante :
bûche (100 / 50,6)
Le tableur fera l'arithmétique.
Faites de même pour les cinq valeurs inconnues/expérimentales.
Représentez graphiquement les valeurs d'absorbance pour les cinq normes, avec la concentration sur l'axe des x et l'absorbance sur l'axe des y. À l'aide du tableur, ajustez une équation linéaire à ce graphique. L'équation sera de la forme y = mx + b. La plupart des tableurs auront une fonction de régression linéaire. Consultez le manuel de l'utilisateur de votre tableur pour plus de détails sur l'utilisation de la fonction de régression linéaire.
Prenez l'équation de la ligne la mieux ajustée de votre tableur et résolvez-la pour y en soustrayant b des deux côtés et en divisant les deux côtés par m. Le résultat ressemblera à ce qui suit :
(y - b)/m = x
où b et m sont des valeurs trouvées par votre tableur.
Vérifiez vos valeurs d'absorbance pour les inconnues et choisissez-en trois qui se situent à peu près dans la même plage que les normes. Utilisez ces trois valeurs d'absorbance pour vos calculs restants. Si les cinq se situent dans la même plage que les normes, vous pouvez utiliser les cinq à la place, mais vous devez en utiliser au moins trois.
Branchez chacune des trois valeurs d'absorbance dans votre équation à la place de y. Rappelez-vous que votre équation était sous la forme suivante :
(y - b)/m = x
Donc, vous voudrez brancher la valeur d'absorbance pour chaque inconnue dans l'équation à la place de y, puis calculer x. Vous pouvez utiliser le tableur pour faire ce calcul pour vous et le rendre plus rapide. Vous avez maintenant calculé la concentration du produit chimique d'intérêt dans trois de vos inconnues diluées. La solution d'origine a été diluée pour préparer ces inconnues, vous devez donc maintenant revenir en arrière et calculer la concentration de la solution d'origine en fonction du facteur de dilution.
Chaque échantillon inconnu que vous avez inséré dans le spectrophotomètre a été dilué par une quantité différente. Par conséquent, vous devez maintenant diviser la concentration que vous avez calculée sur la base de l'absorbance pour chaque lecture inconnue par ce qui suit :
Inconnu 1: Diviser par 0,1 Inconnu 2: Diviser par 0,2 Inconnu 3: Diviser par 0,3 Inconnu 4: Diviser par 0,4 Inconnu 5: Diviser par 0,5
N'oubliez pas, cependant, que ces chiffres sont basés sur l'hypothèse que vous utilisez les dilutions décrites ci-dessus. N'oubliez pas de modifier ces valeurs si vous avez dilué vos échantillons d'une quantité différente.
Additionnez vos résultats et divisez-les par le nombre de résultats. Cela vous donnera une moyenne. Indiquez ce nombre comme votre résultat pour la concentration de la solution d'origine.
Choses dont vous aurez besoin
- Crayon
- Papier
- Calculatrice
- Des gants
- Des lunettes de protection
- Manteau à manches longues
- Spectrophotomètre
- Cuves en verre
- Parafilm
- Kimwipes
- Eau déminéralisée
- Solution que vous souhaitez tester (de concentration inconnue)
- 1 solution étalon molaire du produit chimique présent dans votre solution d'essai
- Pipette graduée & bulbe
- Tubes à essai et support de tube à essai
- Gobelet
Conseils
Cette procédure peut sembler compliquée, mais elle est en fait assez simple une fois que vous avez commencé. Essayez de regarder les deux vidéos sous la section Ressources pour vous familiariser avec la procédure.