Lorsque vous travaillez avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC), un bon étalonnage est absolument essentiel pour garantir des résultats fiables et de qualité. L'étalonnage correct d'un instrument HPLC commence par la fabrication d'un étalon d'étalonnage approprié. Dans la plupart des cas, l'étalonnage nécessite en fait une série d'étalons de concentration croissante afin de produire ce que l'on appelle une courbe d'étalonnage. Il s'agit d'une ligne tracée et de l'équation associée qui décrit la relation entre la concentration du produit chimique testé et la réponse du détecteur HPLC.
Déterminez le produit chimique que vous souhaitez tester à l'aide de la HPLC (l'"analyte"). Par exemple, vous souhaiterez peut-être tester une série de boissons gazeuses pour la teneur en fructose, auquel cas le fructose serait l'analyte.
Obtenir une quantité d'analyte chimique de pureté appropriée. Normalement, la pureté doit être supérieure à 99% et l'analyte doit être acheté auprès d'un fournisseur de produits chimiques réputé. Dans le cas du fructose, par exemple, vous achèteriez du fructose pur chez un vendeur de produits chimiques et non dans une épicerie.
Déterminez les concentrations maximales et minimales anticipées de l'analyte dans les échantillons que vous avez l'intention de tester sur la HPLC. Dans le cas des boissons non alcoolisées, vous examineriez les étiquettes des boissons et détermineriez la teneur en fructose la plus faible et la plus élevée parmi les boissons que vous testerez. Gardez à l'esprit que l'échantillon initial (la boisson gazeuse) peut être dilué ou autrement manipulé pendant la préparation pour l'analyse (selon la méthode HPLC utilisée) et ainsi la concentration d'analyte dans les échantillons réellement injectés sur la HPLC peut être modifié. C'est la concentration d'analyte dans les échantillons telle qu'elle est effectuée sur la HPLC qui doit être prise en compte.
Déterminez le solvant dans lequel vous allez dissoudre votre analyte pour constituer des étalons d'étalonnage. Ce solvant doit être capable de dissoudre correctement l'analyte sur une plage de concentration relativement large (au moins aussi élevée que dans les échantillons que vous avez l'intention de tester). De plus, ce solvant devrait idéalement être assez similaire à la « phase mobile »: le solvant utilisé pour transporter les échantillons à travers l'instrument HPLC.
Calculer la quantité d'analyte nécessaire pour faire une solution « standard de stock » de l'analyte. Ceci est trouvé en multipliant la concentration requise de l'étalon par le volume souhaité. La concentration de l'analyte dans cette solution doit être d'au moins 10 % supérieure à la concentration d'échantillon la plus élevée prévue. Si la concentration de fructose anticipée la plus élevée dans un échantillon de boisson gazeuse est de 8 grammes/100 millilitres, alors l'étalon de stock pourrait être fait à une concentration de 10 grammes de fructose/100 millilitres. Un volume raisonnable est de 500 millilitres, donc 8/100 ml x 500 ml = 40 grammes de fructose seraient nécessaires.
Peser la quantité requise d'analyte à un niveau de précision approprié. Souvent, une valeur de poids en grammes avec une précision d'une ou deux décimales est appropriée, mais une plus grande précision peut être nécessaire pour certaines méthodes.
Transférer l'analyte pesé dans une fiole jaugée du volume nécessaire et ajouter le solvant souhaité jusqu'au repère de remplissage sur la fiole. L'utilisation d'une fiole jaugée (plutôt que d'un bécher gradué par exemple) augmente la précision de la valeur de la concentration étalon stock. Assurez-vous que tout l'analyte est transféré dans le ballon; utilisez une partie du solvant pour le laver, si nécessaire.
Faire une série de dilutions variables de l'étalon stock en transférant des volumes connus de l'étalon stock dans des fioles jaugées, en utilisant des pipettes pour un transfert précis, puis en ajoutant du solvant. La concentration standard la plus basse doit être inférieure à l'échantillon attendu le plus bas à analyser. Dans l'exemple d'une boisson gazeuse, si la plus faible concentration de fructose attendue dans un échantillon est de 2 grammes/100 ml, alors une norme de 1 gramme/100 ml peut être établie. Cela se ferait par une dilution par dix de l'étalon de stock. La série standard devrait inclure un total de 5 ou 6 concentrations, donc des dilutions supplémentaires pour produire des standards de peut-être 3, 5 et 8 grammes de fructose/mL seraient nécessaires. Vous disposez maintenant d'une série de solutions étalons avec lesquelles calibrer la HPLC.
