Tris tai tris (hydroksimetyyli) aminometaani on yleinen biologinen puskuri, jota käytetään koko DNA-uuttoprosessin ajan. Uuttamisen aikana mistä tahansa lähteistä DNA on pH-herkkä. Soluhajotuksen, ei-toivottujen solukomponenttien poistamisen ja saostamisen aikana trisia käytetään stabiilin pH: n ylläpitämiseen. Lisäksi sillä on erityisen tärkeä rooli solujen hajoamisessa.
TL; DR (liian pitkä; Ei lukenut)
DNA-uutto on pH-herkkä prosessi, ja tris-puskurin käyttö auttaa pitämään pH-arvon vakaana solujen hajoamisen ja uuttamisen aikana.
Tris puskurina
Koska pH voi vaikuttaa useisiin solutekijöihin ja vaikuttaa niihin, vakaan pH: n ylläpitäminen on välttämätöntä kokeelliselle tieteelle. Biologiset puskurit, kuten tris, ovat tärkeitä, koska ne voivat ylläpitää vakaan pH: n huolimatta vaikutuksista, jotka muuten saattavat muuttaa pH: ta. Tris (hydroksimetyyli) aminometaani, jonka pKa on 8,1, on tehokas puskuri välillä pH 7 - 9. Neutraalin alueensa vuoksi tris on yleisesti käytetty puskuri biologisissa laboratorioissa. Tris-puskuri on kuitenkin lämpötilaherkkä, ja sitä tulisi käyttää lämpötilassa, jossa se alun perin pH-arvo oli, epätarkkuuksien välttämiseksi.
Solujen hajoaminen
Lyysi tai solujen avaaminen on DNA: n uuton ensimmäinen vaihe. Tämä saavutetaan puskurilla, joka sisältää tris ja EDTA (etyleenidiamiinitetraetikkahappo). EDTA sitoo kaksiarvoisia kationeja, kuten kalsiumia ja magnesiumia. Koska nämä ionit auttavat ylläpitämään solukalvon eheyttä, niiden poistaminen EDTA: lla epävakaa kalvo. Tris on tärkein puskurointikomponentti; sen päärooli on ylläpitää puskurin pH vakaassa pisteessä, yleensä 8,0. Lisäksi tris todennäköisesti vuorovaikutuksessa membraanin LPS: n (lipopolysakkaridi) kanssa, mikä destabiloi kalvon edelleen.
Tris suojaa DNA: ta pH-muutoksilta
Kun solut hajotetaan toisistaan, niiden DNA ja sisältö valuvat puskuriin. Lisäksi RNaasi A (tuhoaa RNA: n), proteaasit (tuhoaa proteiinit) ja SDS (natriumdodekyylisulfaatti, solubilisoi kalvofragmentit) sisältyvät usein. Yhdessä tällä solupitoisuudella ja pirstaleisella RNA: lla ja proteiineilla keitetyllä voi olla suuri vaikutus liuoksen pH-arvoon. Koska DNA on pH-herkkä, trisille on tärkeää puskuroida keitto ja ylläpitää pH vakaassa pisteessä.
DNA-saostus
DNA: n uuton viimeisessä vaiheessa DNA itse uutetaan liuoksesta. Tässä vaiheessa DNA liukenee puskuriin. Uuttamiseksi liuoksesta DNA tehdään liukenemattomaksi lisäämällä etanolia tai isopropanolia (isopropyylialkoholi). Kun tämä on tehty, DNA tulee ilmeiseksi liuoksessa valkoisena thread-aineena. Vaikka DNA voidaan eristää jäljellä olevista solukomponenteista tällä tavalla, se ei ole "käyttökelpoinen", kun se on liukenematon. Eristämisen jälkeen alkoholi poistetaan ja DNA on palautettava biologiseen puskuriin, kuten tris, käytettäväksi.
Tee se itse
Vaikka DNA: n uutto tapahtuu yleisesti tutkimuslaboratorioissa, yleensä käytetään yhtä niistä kaupallisesti saatavissa olevista sarjoista kuka tahansa voi tehdä DNA: n uuttamisen kotona käyttämällä yleisiä taloustavaroita ja vihreää herneitä tai pinaattia. Tässä tapauksessa trisia eikä mitään biologista puskuria ei ole läsnä suojaamaan DNA: ta pH-muutoksilta. Se on kuitenkin visuaalinen tapa auttaa opiskelijoita liittymään solu-DNA: han.