Solun geneettinen suunnitelma koodataan sen geneettiseen materiaaliin tai DNA: han. Koska DNA ei koskaan poistu solun ytimestä, jotta nämä tiedot pääsisivät sytoplasmaan missä muut proteiineja ja biokemiallisia komponentteja, on ensin tarpeen transkriptoida DNA messenger RNA: ksi (mRNA tai poly (A) RNA). Tämä mRNA muuttuu sitten proteiineiksi, jotka suorittavat monia solun toimintoja. Hyvin harvinaisten mRNA: iden havaitsemiseksi tai kvantifioimiseksi, koettimien valmistamiseksi mikrosäteille tai rakenteellisten komplementaaristen DNA-molekyylien kirjastojen valmistamiseksi mRNA on eristettävä. Kokonais-RNA: n (eli koko solun RNA: n) uutto ja sitä seuraava mRNA-eristäminen eivät kuitenkaan sulje pois toisiaan; edellinen on suoritettava mRNA: n uuttamiseksi.
TRIzolihomogenisaatio: Kokonais-RNA sisältää kaiken mRNA: n, siirto-RNA: n, ribosomaalisen RNA: n ja muut koodaamattomat RNA: t. Näiden erottamiseksi muista solukomponenteista solu puretaan ensin auki vapauttaakseen sen sisällys. Tämä tapahtuu suspendoimalla solut uudelleen sentrifugoimalla (pyörimällä suurilla nopeuksilla) TRIzol-reagenssissa (Life Technologies). Muut TRIzolin versiot (kuten Ambionin TRI-reagenssi) toimivat samalla tavalla.
RNA: n kokonaiseristys: Sentrifugointisarjaa käytetään erottamaan solun eri komponentit (proteiinit, DNA, RNA) kerroksiin tai faaseihin suspensiossa. Yläosa, keltainen väri koostuu rasvasta ja voidaan hävittää. Haluttu faasi on sävytetty punaiseksi, sisältää kokonais-RNA: n ja pysyy. Suoritettuaan fenoli-kloroformiuutto ja sarja alkoholipesu käyttäen isopropanolia ja etanolia, RNA voidaan pelletoida mRNA-eristystä varten. Lisää RNaasin estäjiä estämään tätä entsyymiä hajottamasta kokonais-RNA: ta.
mRNA-uutto: On tavallista käyttää kittiä mRNA: iden eristämiseksi, koska kotitekoiset laboratorioprotokollat eivät tuota suuria määriä erittäin puhdistettujen mRNA: iden. Kaupallisia sarjoja ovat Invitrogen's FastTrack 2.0 tai Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Pakki. Nämä perusvaiheet ovat yhteisiä tällaisille sarjoille:
d) sentrifugoidaan tämä näyte ja otetaan talteen supernatantti, joka pestään useita kertoja sarjoissa sitovia ja vähäsuolaisia puskureita, jotka toimitetaan sarjoissa.
Viitteet
- "cDNA-kirjastoprotokollat?"; Ian G. Cowell ja Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro -koodaus- ja käännösprotokollat?"; Martin J. Tymms; 1995
Vinkkejä
- Pidä kaikki reagenssit, solut ja RNA kylmänä upottamalla jäähän. Tämä estää RNA: n hajoamisen kaikista muista entsyymeistä, jotka vapautuvat homogenointiprosessin aikana.
Varoitukset
- Reagenssit, kuten TRIzol, ovat myrkyllisiä eivätkä saa olla kosketuksessa ihon tai limakalvojen kanssa. Noudata aina turvallisia laboratorion käytäntöjä käsitellessäsi tätä reagenssia.
kirjailijasta
Palmer Owyoungilla on kansainvälisen liiketoiminnan maisteri Kalifornian yliopistossa San Diegossa ja Taiteiden kandidaatti sosiologiassa Kalifornian yliopistossa Santa Barbarassa ja on koulutettu molekyyli biologi. Hän on ollut freelance-kirjailija vuodesta 2006. Kirjoittamisen lisäksi hän on kokopäiväinen Forex-kauppias ja Internet-markkinoija.
Valokuvahyvitykset
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images