Es posible clonar organismos completos como la oveja Dolly, pero la clonación de ADN es diferente. Utiliza técnicas de biología molecular para hacer copias idénticas de secuencias de ADN o genes individuales.
Utilizando métodos de ingeniería genética, se identifican y aíslan segmentos del código genético del ADN. La clonación de ADN luego copia el ácido nucleico secuencias en los segmentos.
Las copias idénticas resultantes se pueden utilizar para futuras investigaciones o para aplicaciones biotecnológicas. A menudo, el gen que se copia codifica una proteína que puede formar parte de tratamientos médicos. Tecnología de ADN que incluye Clonación de ADN apoya la comprensión de cómo funcionan los genes y cómo el código genético de los seres humanos influye en el funcionamiento del cuerpo.
Clonación de ADN: definición y descripción general del proceso
La clonación de ADN es el proceso de biología molecular que consiste en hacer copias idénticas de segmentos de ADN ubicados en los cromosomas que contienen el código genético de organismos avanzados.
El proceso genera grandes cantidades de secuencias de ADN diana. El objetivo de la clonación de ADN es producir las propias secuencias de ADN diana o producir las proteínas codificadas en las secuencias diana.
Los dos métodos utilizados en la clonación de ADN se denominan vector de plásmido y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el vector de plásmido método, las hebras de ADN se cortan utilizando enzimas de restricción para producir fragmentos de ADN, y los segmentos resultantes se insertan en vectores de clonación llamados plásmidos para su posterior duplicación. Los plásmidos se colocan en células bacterianas que luego producen copias de ADN o proteínas codificadas.
En el Método de PCR, el segmento de hebras de ADN que se va a duplicar está marcado con enzimas llamadas imprimaciones. Una enzima polimerasa hace copias de la parte marcada de la cadena de ADN. Este método no utiliza enzimas de restricción y puede producir ADN clonado a partir de muestras pequeñas. A veces, los dos métodos de tecnología de ADN se utilizan juntos para incorporar las mejores características de cada uno en una reacción general.
El método del vector plásmido
El vector del método se refiere al plásmido utilizado para contener el segmento de ADN diana que se va a clonar. Los plásmidos son pequeñas hebras circulares de ADN no cromosómico que se encuentra en muchos organismos, incluidos bacterias y virus.
Los plásmidos bacterianos son el vector utilizado para insertar el segmento de ADN diana en células bacterianas para su posterior duplicación.
Seleccionar y aislar el ADN objetivo: Antes de que pueda comenzar el proceso de clonación de ADN, se deben identificar las secuencias de ADN, especialmente los comienzos y los finales de los segmentos de ADN.
Dichas secuencias de ADN se pueden encontrar utilizando ADN clonado existente con secuencias conocidas o estudiando la proteína producida por la secuencia de ADN diana. Una vez que se conoce la secuencia, se pueden usar las enzimas de restricción correspondientes.
Cortar el ADN diana con enzimas de restricción: Las enzimas de restricción se seleccionan para buscar el código de ADN al principio y al final de las secuencias diana.
Cuando las enzimas de restricción encuentran una secuencia codificada especial de pares de bases llamados sitios de restricción, adherirse al ADN en ese lugar y enrollarse alrededor de la molécula de ADN, cortando el hebra. Los segmentos de ADN cortados que contienen la secuencia diana están ahora disponibles para su duplicación.
Elección del vector plasmídico e inserción del ADN diana: Un plásmido adecuado contiene idealmente las mismas secuencias de codificación de ADN que la cadena de ADN de la que se cortó el ADN diana. La hebra circular de ADN del plásmido se corta con las mismas enzimas de restricción que se usaron para cortar el ADN diana.
A Enzima ADN ligasa se utiliza para promover la unión del segmento de ADN, y los extremos del segmento de ADN diana se unen con los extremos cortados del ADN plasmídico. El ADN diana ahora forma parte de la cadena circular de ADN plasmídico.
Insertar el plásmido en una célula bacteriana: Una vez que el plásmido contiene la secuencia de ADN que se va a clonar, la clonación real puede tener lugar mediante un proceso llamado transformación bacteriana. Los plásmidos se insertan en una célula bacteriana como E. coli, y las células con los nuevos segmentos de ADN comenzarán a producir copias y las proteínas correspondientes.
En la transformación bacteriana, las células huésped y los plásmidos se incuban juntos a temperatura corporal durante aproximadamente 12 horas. Las células absorben algunos de los plásmidos y los tratan como su propio ADN plasmídico.
Recolección de ADN y proteínas clonados: La mayoría de los plásmidos utilizados para la clonación de ADN tienen genes de resistencia a antibióticos incorporado en su ADN. A medida que las células bacterianas absorben los nuevos plásmidos, se vuelven resistentes a los antibióticos.
Cuando el cultivo se trata con antibióticos, solo sobreviven las células que han absorbido los nuevos plásmidos. El resultado es un cultivo puro de células bacterianas con ADN clonado. A continuación, se puede recolectar ese ADN o se puede producir la proteína correspondiente.
El método de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
La PCR El método es más simple y copia el ADN existente en su lugar. No requiere cortar con enzimas de restricción ni insertar plásmidoADN secuencias. Esto lo hace especialmente adecuado para clonar muestras de ADN con un número limitado de cadenas de ADN. Si bien el método puede clonar ADN, no se puede utilizar para la producción de la proteína correspondiente.
Desenrollar las hebras de ADN: El ADN de los cromosomas está fuertemente enrollado en una estructura de doble hélice. Calentar el ADN a 96 grados Celsius en un proceso llamado desnaturalización hace que la molécula de ADN se desenrolle y se separe en dos hebras. Esta separación es necesaria porque solo se puede clonar una sola hebra de ADN a la vez.
Selección de imprimaciones: Al igual que con la clonación del ADN del vector plasmídico, las secuencias de ADN que se van a clonar deben identificarse con especial énfasis en el comienzo y el final de los segmentos de ADN. Los cebadores son enzimas que se adhieren a secuencias de código de ADN específicas y deben seleccionarse para marcar los segmentos de ADN diana. Los cebadores correctos se unirán a las secuencias de moléculas de ADN para marcar el comienzo y el final de los segmentos objetivo.
Recocido de la reacción para unir los cebadores: Enfriar la reacción a unos 55 grados Celsius se llama recocido. A medida que la reacción se enfría, los cebadores se activan y se adhieren a la hebra de ADN en cada extremo de un segmento de ADN objetivo. Los cebadores actúan solo como marcadores y no es necesario cortar la hebra de ADN.
Producción de copias idénticas del segmento de ADN diana: En un proceso llamado extensión, se añade a la reacción la enzima polimerasa TAQ sensible al calor. Luego, la reacción se calienta a 72 grados Celsius, activando la enzima. La enzima ADN polimerasa activa se une a los cebadores y copia la secuencia de ADN entre ellos. El proceso inicial de secuenciación y clonación del ADN está completo.
Aumento del rendimiento de ADN clonado: El proceso de hibridación y extensión inicial crea relativamente pocas copias de los segmentos de hebra de ADN disponibles. Para aumentar el rendimiento a través de la replicación adicional del ADN, la reacción se enfría nuevamente para reactivar los cebadores y dejar que se unan a otras cadenas de ADN.
Luego, el recalentamiento de la reacción activa la enzima polimerasa nuevamente y se producen más copias. Este ciclo se puede repetir de 25 a 30 veces.
Utilización conjunta de los métodos de clonación de ADN mediante PCR y vector plasmídico
El método del vector plasmídico se basa en un amplio suministro inicial de ADN para cortar e insertar en plásmidos. Demasiado poco ADN original da como resultado menos plásmidos y un comienzo lento de la producción de ADN clonado.
El método de PCR puede producir una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas cadenas de ADN originales, pero debido a que el ADN no está implantado en una célula bacteriana, la producción de proteínas no es posible.
Para producir la proteína codificada en los fragmentos de ADN que se van a clonar a partir de una pequeña muestra de ADN inicial, los dos métodos pueden usarse juntos y pueden se complementan mutuamente. Primero, el método de PCR se usa para clonar ADN de una muestra pequeña y producir muchas copias.
Luego, los productos de PCR se utilizan con el método del vector plásmido para implantar el ADN producido en células bacterianas que producirán la proteína deseada.
Ejemplos de clonación de ADN para biotecnología
La biología molecular utiliza la clonación de genes y la replicación del ADN con fines médicos y comerciales. Las bacterias con secuencias de ADN clonadas se utilizan para producir medicamentos y reemplazar sustancias que las personas con trastornos genéticos no pueden producir por sí mismas.
Los usos típicos incluyen:
- El gen para insulina humana se clona en bacterias que luego producen la insulina que utilizan los diabéticos.
- El activador del plasminógeno tisular se produce a partir de ADN clonado y se utiliza para ayudar prevenir los coágulos de sangre.
- Hormona del crecimiento humano se puede producir y administrar a personas que no pueden producirlo por sí mismas.
La biotecnología también utiliza la clonación de genes en la agricultura para crear nuevas características en plantas y animales o mejorar las características existentes. A medida que se clonan más genes, el número de usos posibles aumenta exponencialmente.
Ejemplos de clonación de ADN para investigación
Las moléculas de ADN constituyen una pequeña fracción del material de una célula viva y es difícil aislar las influencias de muchos genes. Los métodos de clonación de ADN entregan grandes cantidades de una secuencia de ADN específica para su estudio, y el ADN produce proteínas tal como lo hizo en la célula original. La clonación de ADN permite estudiar esta operación para diferentes genes de forma aislada.
Las aplicaciones típicas de investigación y tecnología de ADN incluyen examinar:
- Función de un gen.
- Mutaciones de un gen.
- La expresion genica.
- Productos genéticos.
- Defectos genéticos.
Cuando se clonan más secuencias de ADN, es más fácil encontrar y clonar secuencias adicionales. Los segmentos de ADN clonados existentes se pueden utilizar para determinar si un segmento nuevo coincide con el anterior y qué partes son diferentes. La identificación de una secuencia de ADN objetivo es entonces más rápida y precisa.
Ejemplos de clonación de ADN para terapia génica
En terapia de genes, se presenta un gen clonado a las células de un organismo cuyo gen natural está dañado. Un gen vital que produce una proteína necesaria para la función de un organismo específico podría mutar, cambiar por radiación o verse afectado por virus.
Cuando el gen no funciona correctamente, falta una sustancia importante en la célula. La terapia genética intenta Reemplazar el gen con una versión clonada que producirá la sustancia requerida..
La terapia génica es todavía experimental y pocos pacientes se han curado con la técnica. Los problemas radican en identificar el gen único responsable de una afección médica y entregar muchas copias del gen a las células correctas. A medida que la clonación de ADN se ha generalizado, la terapia génica se ha aplicado en varias situaciones específicas.
Las aplicaciones exitosas recientes incluyen:
- Enfermedad de Parkinson: Utilizando un virus como vector, se inyectó un gen relacionado con la enfermedad de Parkinson en el cerebro medio de los pacientes. Los pacientes experimentaron mejores habilidades motoras sin efectos secundarios adversos.
- Deficiencia de adenosina desaminasa (ADA): Un trastorno inmunológico genético se trató mediante la extracción de las células madre sanguíneas de los pacientes y la inserción del gen ADA. Como resultado, los pacientes pudieron producir al menos parte de su propia ADA.
- Hemofilia: Las personas con hemofilia no producen proteínas específicas que ayuden a la coagulación de la sangre. Se insertó un gen para la producción de una de las proteínas faltantes en las células hepáticas de los pacientes. Los pacientes produjeron la proteína y se redujeron los incidentes hemorrágicos.
La terapia génica es una de las aplicaciones más prometedoras de la clonación de ADN, pero es probable que proliferen otros usos nuevos a medida que se estudien más secuencias de ADN y se determine su función. La clonación de ADN proporciona la materia prima para la ingeniería genética en las cantidades necesarias.
Cuando se conoce el papel de los genes y se puede asegurar su función adecuada mediante la sustitución de los genes defectuosos genes, muchas enfermedades crónicas e incluso el cáncer se pueden atacar y tratar a nivel genético utilizando ADN tecnología.
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