Según el sitio web BioWeb de la Universidad de Wisconsin, un cebador de PCR es un oligonucleótido sintético corto (generalmente entre 18 hasta 25 bases de largo) utilizado para amplificar regiones específicas de ADN en una técnica de biología molecular conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se necesitan tanto un cebador directo como inverso, diseñado para ser complementos inversos de la cadena de ADN, para flanquear y unirse a la región de ADN deseada. Cuando los científicos quieren realizar una investigación sobre un gen o una región de ADN específicos, primero deben realizar una PCR para adquirir suficiente de la región objetivo con la que trabajar. El diseño de secuencias de cebadores para la región de interés puede ser necesario si aún no están disponibles a través de investigaciones previamente publicadas o por medios comerciales.
Obtenga la secuencia de nucleótidos del gen o la región de ADN de interés y decida cuánto tiempo desea amplificar un fragmento. El cebador directo e inverso está diseñado para unirse al principio y al final del fragmento deseado. Normalmente, los métodos de PCR convencionales utilizan cebadores que flanquean una región de entre 100 y 1000 pares de bases de largo, mientras que los métodos de PCR en tiempo real utilizan fragmentos de entre 50 y 200 pares de bases de largo.
Decide en qué lugar de la secuencia quieres que se coloquen los cebadores. Por ejemplo, es posible que desee la ubicación cerca del extremo de 5 'o 3' de la secuencia o en el medio. Si lo desea, designe la ubicación de los cebadores para abarcar un intrón.
Diseñe imprimaciones para que tengan una longitud de 18 a 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph. D., de Brinkmann Instruments Inc., sugiere que esta longitud es lo suficientemente larga para ser extremadamente específica para la región de ADN deseada, pero lo suficientemente corta para unirse (templar) fácilmente. La temperatura de fusión del imprimador (Tm) debe estar entre 55 y 80 grados Celsius, lo suficientemente baja para permitir una fusión completa a 90 grados Celsius o superior, pero lo suficientemente alta para permitir el recocido. El contenido de GC (porcentaje de G y C en la secuencia) debe estar entre el 40 y el 60 por ciento. El extremo 3 'de la secuencia del cebador debe terminar en una C o una G (llamada abrazadera GC) para promover la unión, ya que G y C los nucleótidos tienen enlaces más fuertes, sin embargo, evite tener tres o más G o C en las últimas cinco bases de la secuencia.
Evite tener series de cuatro o más de una base (como ACCCC ...) o cuatro o más repeticiones de di-nucleótidos (como ATATATAT ...) porque pueden causar cebado incorrecto. Diseñe cebadores sin homología intra-cebador (más de tres bases que se complementan dentro de una cebador en sí) o homología entre cebadores (donde el cebador directo e inverso tienen complementarios secuencias). Esto puede causar autodímeros o dímeros de cebadores, donde los cebadores se unen a sí mismos en lugar de unirse a la secuencia de ADN deseada.
Utilice recursos en línea y sitios web que ayuden en el diseño de la cartilla o que ayuden a verificar las secuencias de la cartilla en busca de autocomplementariedad o la posibilidad de crear estructuras secundarias como horquillas. Algunos sitios web de diseño de imprimaciones incluyen Primer3 del Instituto de Tecnología de Massachusetts, Primer-Blast del Centro Nacional de Información Biotecnológica y OligoAnalyzer de Integrated DNA Technologies.