Antes de que puedan secuenciar el ADN o alterarlo mediante ingeniería genética, los científicos deben primero aislarlo. Esto puede parecer una tarea difícil, ya que las células contienen una amplia variedad de otros compuestos como proteínas, grasas, azúcares y moléculas pequeñas. Afortunadamente, los biólogos pueden hacer uso de las propiedades químicas del ADN para separar el ADN de estos contaminantes y prepararlo para estudios posteriores. Este proceso se llama extracción de ADN.
Lisis celular
Hay muchas técnicas diferentes empleadas para la extracción de ADN. El utilizado por un laboratorio individual depende del tipo de experimento que se va a realizar y de la pureza que debe tener el ADN. Los científicos generalmente comienzan con una muestra que contiene células (una muestra de tejido o sangre, por ejemplo) y abren las células o las lisan. Hay varias formas de lisar las células. Agregar un detergente hará que se deshagan, al igual que los someterá a ondas sonoras de alta frecuencia. Alternativamente, mezclar la muestra con perlas de vidrio y vibrarla rápidamente romperá físicamente las células y liberará su contenido.
Enfoques rápidos y sucios
Si no se requiere una alta pureza, los científicos pueden agregar una enzima llamada proteinasa K para descomponer la mayoría de las proteínas en la muestra y luego usarla tal cual. Sin embargo, esta técnica es muy sucia, ya que la mayoría de los contaminantes todavía están presentes, por lo que solo es adecuada si la velocidad es una prioridad y la pureza no es un problema. Otro enfoque rápido y sucio es eliminar las proteínas aumentando la concentración de sal agregando sales como acetato de amonio o potasio para obligar a las proteínas a precipitar. Esta técnica también es bastante sucia ya que todavía hay muchos otros contaminantes presentes.
Extracción de fenol-cloroformo
Otro método consiste en lisar las células con detergente y luego mezclar la solución con alcohol isoamílico, cloroformo y fenol. Luego, la solución se separa en dos capas. Las proteínas terminan en la capa orgánica superior, mientras que el ADN permanece en la capa acuosa inferior. Esta técnica requiere un control cuidadoso de la concentración de sal y el pH para obtener buenos resultados. Lleva mucho tiempo y tanto el fenol como el cloroformo son sustancias químicas altamente tóxicas. En consecuencia, si bien las extracciones con fenol-cloroformo alguna vez fueron rutinarias, otras técnicas se han vuelto más populares en los últimos años.
Cromatografía de intercambio aniónico
La cromatografía de intercambio aniónico ofrece una mayor pureza y resultados más consistentes que la extracción con fenol-cloroformo. Un tubo o columna está lleno de pequeñas partículas que tienen sitios cargados positivamente en ellos donde se puede unir una molécula o anión cargados negativamente. El ADN se une a estos sitios de intercambio aniónico mientras que otros contaminantes como proteínas y ARN se eliminan de la columna. Posteriormente, se usa una solución rica en sal para extraer el ADN de la columna.
Kits
La técnica más rápida y quizás más confiable para purificar el ADN es el uso de un kit fabricado especialmente. Estos kits contienen membranas de gel de sílice en un tubo. El ADN se adhiere a la membrana mientras que otros contaminantes se eliminan mediante una serie de soluciones salinas especialmente preparadas que vienen con el kit. Finalmente, el ADN se lava de la columna con una solución baja en sal. Estos kits son rápidos, fáciles de usar y ofrecen resultados reproducibles.
Absorbancia
Una vez que el ADN ha sido aislado y resuspendido en una solución tampón con pH controlado, el último paso es probar su pureza. Una manera fácil y conveniente de hacerlo es verificando cuánta luz ultravioleta absorbe en las longitudes de onda de 260 y 280 nanómetros. La absorción a 260 nanómetros dividida por la absorción a 280 nanómetros debería ser igual a 1,8 si el ADN es puro. La medición de la absorbancia a 260 nanómetros también le permite determinar la concentración del ADN.