El modelo genético de una célula está codificado dentro de su material genético o ADN. Como el ADN nunca sale del núcleo de la célula, para que esta información ingrese al citoplasma donde otros proteínas y componentes bioquímicos residen, es necesario primero transcribir el ADN en ARN mensajero (ARNm o poli (A) ARN). Este ARNm luego se traduce en proteínas que llevan a cabo muchas funciones de la célula. Para detectar o cuantificar ARNm muy raros, hacer sondas para microarrays o construir bibliotecas de moléculas de ADN complementarias, se debe aislar el ARNm. Sin embargo, la extracción del ARN total (es decir, todo el ARN de una célula) y el posterior aislamiento del ARNm no son procesos mutuamente excluyentes; el primero debe realizarse para que se extraiga el ARNm.
Homogeneización de TRIzol: el ARN total incluye todo el ARNm, ARN de transferencia, ARN ribosómico y otros ARN. Para separar estos de otros componentes celulares, la celda primero se abre de golpe para liberar su contenido. Esto se hace resuspendiendo las células sedimentadas por centrifugación (girando a altas velocidades) en TRIzol Reagent (Life Technologies). Otras versiones de TRIzol (como el reactivo TRI de Ambion) funcionan de manera similar.
Aislamiento de ARN total: se utiliza una serie de centrifugaciones para separar los diferentes componentes (proteínas, ADN, ARN) de la célula en capas o fases dentro de la suspensión. La fase superior, de color amarillo, está compuesta de grasa y se puede desechar. La fase deseada se tiñe de rojo, contiene el ARN total y se retiene. Después de realizar una extracción con fenol-cloroformo y una serie de lavados con alcohol usando isopropanol y etanol, el ARN se puede sedimentar para el aislamiento del ARNm. Agregue inhibidores de ARNasa para evitar que esta enzima degrade el ARN total.
Extracción de ARNm: es común utilizar un kit para aislar ARNm, ya que los protocolos de laboratorio caseros no generan grandes cantidades de ARNm altamente purificados. Los kits comerciales incluyen FastTrack 2.0 de Invitrogen o aislamiento de ARNm poli (A) puro de Ambion Equipo. Estos pasos básicos son comunes a dichos kits:
d) Centrifugue esta muestra y recupere el sobrenadante, que se lava varias veces en una serie de tampones de unión y bajos en sal que se proporcionan en los kits.
Referencias
- "¿Protocolos de biblioteca de ADNc?"; Ian G. Cowell y Caroline A. Austin; 1997
- "¿Protocolos de transcripción y traducción in vitro?"; Martín J. Tymms; 1995
Consejos
- Mantenga fríos todos los reactivos, células y ARN sumergiéndolos en hielo. Esto evita que el ARN sea degradado por otras enzimas que se liberen durante el proceso de homogeneización.
Advertencias
- Los reactivos como TRIzol son tóxicos y no deben estar en contacto con la piel o las membranas mucosas. Observe siempre los protocolos de laboratorio seguros al manipular este reactivo.
Sobre el Autor
Palmer Owyoung tiene una Maestría en Artes en Negocios Internacionales de la Universidad de California en San Diego y una Licenciado en sociología de la Universidad de California en Santa Bárbara y es un especialista molecular capacitado. biólogo. Es escritor autónomo desde 2006. Además de escribir, es comerciante de Forex y comercializador de Internet a tiempo completo.
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