La cromatografía líquida de alta resolución es una técnica para el análisis de laboratorio de una mezcla. Es un tipo de cromatografía eficiente que utiliza alta presión, en lugar de simplemente gravedad, para impulsar una muestra de una mezcla a través de una columna. Se inyecta una muestra, luego una bomba que contiene altas cantidades de presión ayuda a mover la muestra a lo largo de una columna de relleno, donde se separa en componentes individuales. Luego, esta separación es analizada por un detector para obtener resultados.
Sitio de inyección
Para inyectarla en una HPLC, una muestra debe disolverse primero en un disolvente líquido polar, preferiblemente uno con espectros de HPLC conocidos, de modo que sus datos puedan distinguirse de los de la muestra. La solución líquida que contiene la muestra se coloca en el instrumento y se envía a la columna. La ubicación real del lugar de la inyección depende de la marca de los instrumentos. En la mayoría de los casos, el proceso de inyección está automatizado, pero en algunos casos un trabajador de laboratorio debe inyectar la muestra con una pequeña aguja de jeringa.
Componente de la bomba
El componente de bomba de la unidad de HPLC es necesario porque proporciona la presión que impulsa la muestra a través de la columna. La fuerza de la bomba varía, pero una poderosa puede producir una presión de hasta 6000 psi, o libras por pulgada cuadrada, que se aplica después de inyectar la muestra. Esto permite que la muestra pase a través de la columna de manera más rápida y eficiente que si goteara usando solo la fuerza de la gravedad.
Descripción de la columna
La mayor velocidad de una muestra que pasa a través de la columna por una bomba permite el uso de un tipo de columna diferente a las utilizadas en la cromatografía líquida simple. El material de relleno de la columna puede tener un tamaño de partícula mucho más pequeño, lo que aumenta el área de superficie y, por lo tanto, ayuda a las interacciones de la muestra con la columna. La mayoría de las columnas de HPLC funcionan mediante polaridad. La muestra se disuelve en un disolvente polar y la columna está formada en gran parte por hidrocarburos no polares. Las partes polares de la molécula de muestra pasan a través de la columna muy rápidamente porque interactúan principalmente con la solvente, mientras que los componentes no polares de la muestra permanecen en la columna, formando interacciones débiles con la columna componentes. Por lo tanto, los componentes de la muestra salen de la columna en orden de más polares a más no polares.
Función de detector
Los detectores también varían según el tipo de instrumento de HPLC que se utilice. Sin embargo, la mayoría funciona de la misma forma básica. Una fuente de luz ultravioleta brilla sobre los componentes de la muestra separados a medida que salen de la columna. La mayoría de los compuestos orgánicos absorben una cierta cantidad de luz, por lo que a medida que pasan por el haz de luz aplicado, un detector puede captar cuánta luz se absorbe. El detector también registra el tiempo de retención de los componentes según el orden en que salen de la columna. Luego, esta salida se puede analizar en función del área del pico para determinar la naturaleza exacta de los componentes de la muestra.