Die Polymerase-Kettenreaktion oder PCR ist eine Technik, die ein DNA-Fragment in viele Fragmente fotokopiert – exponentiell viele. Der erste Schritt bei der PCR besteht darin, die DNA so zu erhitzen, dass sie denaturiert oder zu Einzelsträngen verschmilzt. Der Aufbau der DNA ähnelt einer Strickleiter, bei der die Sprossen Seile mit magnetischen Enden sind. Die Magnete verbinden sich zu den Sprossen, den sogenannten Basenpaaren, und widerstehen so einem Auseinanderziehen. Jedes DNA-Fragment schmilzt bei unterschiedlichen Temperaturen zu Einzelsträngen. Zu verstehen, wie die DNA-Struktur durch die einzelnen Teile der DNA zusammengehalten wird, wird Aufschluss darüber geben, warum verschiedene DNA-Fragmente schmelzen bei unterschiedlichen Temperaturen und warum so hohe Temperaturen im ersten Fall benötigt werden Platz.
Schmelzen! Schmelzen!
Der erste Schritt der PCR besteht darin, die DNA zu schmelzen, so dass sich doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA trennt. Bei Säugetier-DNA beinhaltet dieser erste Schritt normalerweise eine Hitze von etwa 95 Grad Celsius (etwa 200 Fahrenheit). Bei dieser Temperatur brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den A-T- und G-C-Basenpaaren oder Sprossen in der DNA-Leiter auseinander und entpacken die doppelsträngige DNA. Die Temperatur ist jedoch nicht heiß genug, um das Phosphat-Zucker-Rückgrat zu brechen, das die Einzelstränge oder die Pole der Leiter bildet. Die vollständige Trennung der Einzelstränge bereitet sie auf den zweiten Schritt der PCR vor, bei dem es sich um das Abkühlen handelt, damit kurze DNA-Fragmente, sogenannte Primer, an die Einzelstränge binden können.
Magnetische Reißverschlüsse
Ein Grund dafür, dass DNA auf die hohe Temperatur von 95 Grad Celsius erhitzt wird, ist, dass je länger der DNA-Doppelstrang ist, desto mehr will er zusammenbleiben. Die DNA-Länge ist ein Faktor, der den für die PCR an diesem DNA-Stück gewählten Schmelzpunkt beeinflusst. Die Basenpaare A-T und G-C in der doppelsträngigen DNA verbinden sich miteinander, um die doppelsträngige Struktur zusammenzuhalten. Je mehr aufeinanderfolgende Basenpaare zwischen zwei Einzelsträngen gebunden sind, desto mehr wollen auch ihre Nachbarn binden und desto stärker wird die Anziehung zwischen den beiden Strängen. Es ist wie ein Reißverschluss aus kleinen Magneten. Wenn Sie den Reißverschluss schließen, möchten die Magnete natürlich den Reißverschluss schließen und bleiben.
Stärkere Magnete haften fester
Ein weiterer Faktor, der beeinflusst, welche Schmelztemperatur für Ihr interessierendes DNA-Fragment zu wählen ist, ist die Menge an G-C-Basenpaaren, die in diesem Fragment vorhanden sind. Jedes Basenpaar ist wie zwei Mini-Magnete, die sich anziehen. Ein Paar aus G und C wird viel stärker angezogen als ein A- und T-Paar. Daher benötigt ein DNA-Stück, das mehr G-C-Paare hat als ein anderes Fragment, eine höhere Temperatur, bevor es zu Einzelsträngen schmilzt. DNA absorbiert auf natürliche Weise ultraviolettes Licht – bei einer Wellenlänge von 260 Nanometern, um genau zu sein – und einzelsträngige DNA absorbiert mehr Licht als doppelsträngige DNA. Die Messung der absorbierten Lichtmenge ist also eine Möglichkeit zu messen, wie viel Ihre doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen verschmolzen ist. Der "magnetische Reißverschluss"-Effekt von G-C- und A-T-Basenpaaren verursacht ein Diagramm der Lichtabsorption von doppelsträngige DNA, aufgetragen gegen Temperaturerhöhung als sigmoidal, wie ein S und nicht a gerade Linie. Die Kurve des S stellt den Teamwork-Widerstand dar, den die Basenpaare gegen die Hitze ausüben, weil sie sich nicht trennen wollen.
Der halbe Punkt
Die Temperatur, bei der ein DNA-Stück zu Einzelsträngen schmilzt, wird als Schmelztemperatur bezeichnet, die mit der Abkürzung „Tm“ bezeichnet wird. Dies gibt die Temperatur an, bei der die Hälfte der DNA in einer Lösung zu Einzelsträngen geschmolzen ist und die andere Hälfte noch doppelsträngig ist bilden. Die Schmelztemperatur ist für jedes DNA-Fragment unterschiedlich. Säugetier-DNA hat einen G-C-Gehalt von 40 %, was bedeutet, dass die restlichen 60 % der Basenpaare As und Ts sind. Sein 40% G-C-Gehalt führt dazu, dass die DNA von Säugetieren bei 87 Grad Celsius (etwa 189 Fahrenheit) schmilzt. Aus diesem Grund besteht der erste Schritt der PCR an Säugetier-DNA darin, sie auf 94 Grad Celsius (201 Fahrenheit) zu erhitzen. Nur sieben Grad heißer als die Schmelztemperatur und alle Doppelstränge schmelzen vollständig zu Einzelsträngen.