Molekulární klonování je běžná biotechnologická metoda, kterou by měl každý student a výzkumný pracovník znát. Molekulární klonování pomocí typu enzymu nazývaného restrikční enzym k rozřezání lidské DNA na fragmenty, které pak mohou být vloženy do plazmidové DNA bakteriální buňky. Restrikční enzymy rozřezaly dvouvláknovou DNA na polovinu. V závislosti na restrikčním enzymu může mít řez za následek buď lepivý konec, nebo tupý konec. Lepkavé konce jsou užitečnější při molekulárním klonování, protože zajišťují, že fragment lidské DNA je vložen do plazmidu správným směrem. Proces ligace nebo fúze fragmentů DNA vyžaduje méně DNA, pokud má DNA lepivé konce. A konečně, několik restrikčních enzymů s lepivým koncem může produkovat stejný lepivý konec, i když každý enzym rozpoznává jinou restrikční sekvenci. To zvyšuje pravděpodobnost, že vaše oblast zájmu DNA může být vyříznuta enzymy s lepkavým koncem.
Restrikční enzymy a restrikční weby
Restrikční enzymy jsou enzymy, které štěpí rozpoznávají specifické sekvence na dvouvláknové DNA a štěpí DNA na polovinu v této sekvenci. Rozpoznaná sekvence se nazývá restrikční místo. Restrikční enzymy se nazývají endonukleázy, protože štěpí dvouvláknovou DNA, což je způsob, jakým DNA normálně existuje, v místech, která jsou mezi konci DNA. Existuje více než 90 různých restrikčních enzymů. Každý rozpoznává odlišné omezující místo. Restrikční enzymy štěpí příslušná restrikční místa 5 000krát účinněji než jiná místa, která nerozpoznávají.
Správná orientace
Restrikční enzymy se dělí do dvou obecných tříd. Buď rozřezali DNA na lepivé konce, nebo tupé konce. Lepivý konec má krátkou oblast nukleotidů, stavebních kamenů DNA, která je nepárová. Tato nepárová oblast se nazývá převis. Přesah se říká, že je lepkavý, protože to chce a bude spárovat s dalším lepivým koncem, který má doplňkovou sekvenci přesahu. Lepkavé konce jsou jako dávno ztracená dvojčata, která se po svém setkání snaží pevně obejmout. Na druhou stranu tupé konce nejsou lepivé, protože všechny nukleotidy jsou již spárovány mezi dvěma řetězci DNA. Výhodou lepivých konců je, že fragment lidské DNA se vejde do bakteriálního plazmidu pouze v jednom směru. Naproti tomu, pokud má jak lidská DNA, tak bakteriální plazmid tupé konce, může být lidská DNA vložena do plazmidu hlava-ocas nebo ocas-hlava.
Ligace lepivých konců vyžaduje méně DNA
Ačkoli DNA s tyčovými konci se snáze vyhledávají kvůli své „lepivosti“, ani lepkavé konce ani tupé konce se nemohou spojit do souvislého kusu DNA. Tvorba souvislého kusu DNA, který je zcela spojen, vyžaduje enzym nazývaný ligáza. Ligázy spojují páteř nukleotidů na lepivých nebo tupých koncích a výsledkem je souvislý řetězec nukleotidů. Protože lepkavé konce se díky vzájemné přitažlivosti nacházejí rychleji, proces ligace vyžaduje méně lidské DNA a méně plazmidové DNA. Tupé konce DNA a plazmidů jsou méně pravděpodobné, že se navzájem najdou, a proto ligace tupých konců vyžaduje, aby se do zkumavky vložilo více DNA.
Různé enzymy mohou mít stejný lepkavý konec
Restrikční místa se nacházejí v celém genomu organismů, ale nejsou rovnoměrně rozmístěna. V plazmidech mohou být konstruovány tak, aby byly umístěny hned vedle sebe. Vědci, kteří chtějí vyříznout fragment lidské DNA z lidského genomu, musí najít restrikční místa, která jsou před a za oblastí fragmentu. Kromě toho, že je zajištěno, že fragment DNA je vložen správným směrem, mohou různé enzymy s lepkavým koncem vytvořit stejný lepkavý konec, i když rozpoznávají různé restrikční sekvence. Například BamHI, BglII a Sau3A mají různé rozpoznávací sekvence, ale produkují stejný lepivý konec GATC. To zvyšuje pravděpodobnost, že budou existovat restrikční místa s lepivým koncem, která lemují váš lidský gen, který nás zajímá.
