Při práci s vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) je pro zajištění spolehlivých a kvalitních výsledků absolutně nezbytná dobrá kalibrace. Správná kalibrace přístroje HPLC začíná vytvořením vhodného kalibračního standardu. Ve většině případů vyžaduje kalibrace ve skutečnosti řadu standardů zvyšující koncentraci, aby mohla být vytvořena tzv. Kalibrační křivka. Toto je zakreslená čára a související rovnice, která popisuje vztah mezi koncentrací testované chemikálie a reakcí detektoru HPLC.
Určete chemickou látku, kterou chcete otestovat pomocí HPLC („analyt“). Můžete například chtít otestovat řadu nealkoholických nápojů na obsah fruktózy, v takovém případě bude analytem fruktóza.
Získejte množství chemikálie analytu vhodné čistoty. Normálně by čistota měla být vyšší než 99% a analyt by měl být zakoupen od renomované společnosti dodávající chemikálie. Například v případě fruktózy byste kupovali čistou fruktózu od prodejce chemikálií, a nikoli od obchodu s potravinami.
Určete maximální a minimální očekávané koncentrace analytu ve vzorcích, které chcete testovat na HPLC. V případě nealkoholických nápojů byste prozkoumali štítky nápojů a určili nejnižší a nejvyšší obsah fruktózy mezi nápoji, které budete testovat. Pamatujte, že počáteční vzorek (nealkoholický nápoj) může být během přípravy na analýzu naředěn nebo jinak manipulován (v závislosti na použité metodě HPLC) a tak může být koncentrace analytu ve vzorcích skutečně vstřikovaných na HPLC upraveno. Je třeba vzít v úvahu koncentraci analytu ve vzorcích prováděných pomocí HPLC.
Určete rozpouštědlo, ve kterém rozpustíte analyt, abyste vytvořili kalibrační standardy. Toto rozpouštědlo musí být schopné správně rozpustit analyt v relativně širokém rozmezí koncentrací (alespoň tak vysokých jako ve vzorcích, které chcete testovat). Toto rozpouštědlo by také mělo být v ideálním případě docela podobné „mobilní fázi:“ rozpouštědlu použitému k přenosu vzorků nástrojem HPLC.
Vypočítejte množství analytu potřebného k přípravě "zásobního standardního" roztoku analytu. To se zjistí vynásobením požadované koncentrace základního standardu požadovaným objemem. Koncentrace analytu v tomto roztoku by měla být nejméně o 10% vyšší než nejvyšší očekávaná koncentrace vzorku. Pokud je nejvyšší očekávaná koncentrace fruktózy ve vzorku nealkoholického nápoje 8 gramů / 100 mililitrů, pak je možné připravit standardní zásobu na koncentraci 10 gramů fruktózy / 100 mililitrů. Přiměřený objem je 500 mililitrů, takže by bylo zapotřebí 8/100 ml x 500 ml = 40 gramů fruktózy.
Odvážte požadované množství analytu na vhodnou úroveň přesnosti. Často je vhodná hodnota hmotnosti v gramech s přesností na jedno nebo dvě desetinná místa, ale u některých metod může být nutná větší přesnost.
Odvážený analyt se převede do odměrné baňky s potřebným objemem a přidá se požadované rozpouštědlo ke značce plnění na baňce. Použití odměrné baňky (spíše než odměrná kádinka, například) zvyšuje přesnost hodnoty standardní standardní koncentrace. Zajistěte, aby byl veškerý analyt přenesen do baňky; je-li to nutné, použijte k promytí část rozpouštědla.
Připravte řadu různých ředění základního standardu převedením známých objemů základního standardu do odměrných baněk pomocí pipet pro přesný přenos a poté přidáním rozpouštědla. Nejnižší standardní koncentrace by měla být nižší než nejnižší očekávaný vzorek, který má být analyzován. V příkladu nealkoholických nápojů, pokud je nejnižší očekávaná koncentrace fruktózy ve vzorku 2 gramy / 100 ml, lze vytvořit standard 1 gram / 100 ml. To by bylo provedeno desetinásobným zředěním standardu akcií. Standardní série by měla zahrnovat celkem 5 nebo 6 koncentrací, takže by bylo zapotřebí dalších ředění k produkci standardů asi 3, 5 a 8 gramů fruktózy / ml. Nyní máte řadu standardních řešení, pomocí kterých můžete kalibrovat HPLC.