Каква е функцията на проследяването на багрилото в гел електрофорезата?

Гел електрофореза е често използвана лабораторна техника с много практически приложения, включително ДНК пръстови отпечатъци и геномно секвениране. Процесът включва разделяне ДНК фрагменти, използващи електрически ток, докато проследяват скоростта на молекулярно движение през филтриращ гел.

Добавянето на синьо или оранжево багрило за проследяване към безцветни ДНК проби ви позволява да видите пробата си и да получите информация за това как ДНК молекулите се движат по време на електрофореза. Идентификацията се основава на размера на ДНК лентите върху гела след миграция на молекулите.

Гел електрофореза изтегля фрагменти на ДНК през гел с помощта на електрически ток, за да изолира и идентифицира ДНК молекулите по размер и електрически заряд. Гелът често се прави с агароза на прах - полизахарид, извлечен от морски водорасли.

Агарозата се добавя към буферен разтвор от вода и сол и сместа се нагрява и охлажда, за да се получи порест гел, който ще действа като филтрираща матрица по време на процедурата за електрофореза. След това гелът се поставя в устройство за електрофореза и се покрива с буферен разтвор, който провежда

Разтвори, съдържащи ДНК и зареждащи багрила, се пипетират в малки ямки в гела, които трябва да се направят по време на подготовката на гела. Багрилада ти помогнаВижте ясно пробата че добавяте към ямките с гел, разположени близо до отрицателния електрод на електрофорезата.

Позитивен електрод е разположен на противоположния край. Известен стандарт на ДНК фрагменти се поставя в първата ямка, която ще създаде стълба от ДНК ленти за целите на сравнението и идентификацията.

Фосфатният скелет на молекулите на ДНК придава на ДНК отрицателен заряд. Противоположностите се привличат, следователно ДНК молекулите се привличат към положителния електрод и започват да се движат или „мигрират“, когато е включен електрически ток.

ДНК фрагментите с по-малък размер се движат по-бързо от по-големите фрагменти, тъй като срещат по-малко съпротивление, докато мигрират през порестата матрица на гела. ДНК фрагменти с подобен размер образуват ивици от ДНК в гела.

ДНК е безцветна, така че добавянето проследяващи багрила на проба ви помага определете скоростта на движение от различни по размер протеинови молекули в гела по време на електрофореза. Примерите за зареждане на багрила, които се движат с ДНК пробата, включват бромофенолсин и ксилен цианол.

Избраното багрило не трябва да реагира или да променя ДНК. Бромофеноловото синьо е багрило, използвано за проследяване на по-малки ДНК вериги, съдържащи около 400 базови двойки, докато ксилоловият цианол е по-добър за по-големи ДНК вериги с до 8 000 базови двойки. Избраното багрило не трябва да реагира или да променя ДНК.

Когато подготвяте вашата ДНК проба за електрофореза, ще трябва да добавите глицерол и вода заедно с зареждащите багрила. Глицеролът е тежко, сиропирано вещество, което придава по-голяма плътност на ДНК пробата, преди да бъде поставена в ямките в единия край на гелния лист.

Без глицерол, ДНК пробата би се разпръснала, вместо да потъне и да образува слой в кладенеца, както би трябвало да направи, за да образува стълба от ДНК.

Електрофорезата на натриев додецил сулфат полиакриламиден гел (SDS PAGE) е техника, подходяща за разделяне на протеини и аминокиселини, които са по-малки и по-сложни от линейните ДНК молекули. Полиакриламид (SDS PAGE гел) се използва вместо агарозен гел за електрофореза.

Бромофенолно синьо (BPB) се добавя към пробния буфер като проследяваща боя който се движи в същата посока на разделяне на протеините и очертава предния им ръб.

ДНК-свързващо багрило като оранжев цвят етидиев бромид може да се добави към гела или към буфера за електрофореза. Както подсказва името, багрилото се прикрепя към молекулата на ДНК.

Трябва да се внимава много при работа с това мутагенно багрило, тъй като то може да се свърже с ДНК в кожните клетки. За разлика от проследяващите багрила, етидиев бромид флуоресцира ярко под UV светлина, което прави ДНК лентите видими.