Според уебсайта BioWeb на Университета в Уисконсин, PCR праймерът е кратък, синтетичен олигонуклеотид (обикновено между 18 до 25 бази), използвани за усилване на специфични области на ДНК в техника на молекулярна биология, известна като полимеразна верижна реакция (PCR). Необходими са както правен, така и обратен праймер, проектиран да бъде обратен комплемент на ДНК веригата, за да се фланкира и да се свърже с желаната ДНК област. Когато учените искат да извършат изследвания върху определен ген или регион на ДНК, първо трябва да извършат PCR, за да придобият достатъчно от целевия регион, с който да работят. Може да се наложи проектиране на последователности от праймери за интересуващия регион, ако те вече не са налични чрез предварително публикувани изследвания или по търговски средства.
Получете нуклеотидната последователност на интересуващия ген или ДНК регион и решете колко дълго фрагмент искате да амплифицирате. Правият и реверсивният грунд е проектиран да се свързва в началото и в края на желания фрагмент. Обикновено конвенционалните PCR методи използват праймери, които фланкират регион с дължина между 100 до 1000 базови двойки, докато PCR методите в реално време използват фрагменти с дължина около 50 до 200 базови двойки.
Решете къде в последователността искате да лежат грундовете. Например, може да искате местоположението близо до 5 'или 3' края на последователността или в средата. Ако желаете, посочете местоположението на праймерите, които да обхващат интрон.
Проектирайте грундовете с дължина от 18 до 24 основи. Винсент Р. Prezioso, доктор по медицина, от Brinkmann Instruments Inc., предполага, че тази дължина е достатъчно дълга, за да бъде изключително специфична за желания ДНК регион, но достатъчно къса, за да се свързва (отгрява) лесно. Температурата на топене на грунда (Tm) трябва да бъде между 55 и 80 градуса по Целзий, достатъчно ниска, за да позволи пълно топене при или над 90 градуса по Целзий, но достатъчно висока, за да позволи отгряване. Съдържанието на GC (процент на Gs и Cs в последователността) трябва да бъде между 40 и 60 процента. 3 'краят на праймерната последователност трябва да завършва с C или G (наречен GC скоба), за да се насърчи свързването, тъй като G и C нуклеотидите имат по-силни връзки, но избягвайте да имате три или повече Gs или Cs в последните пет бази на последователността.
Избягвайте повторения от четири или повече от една основа (като ACCCC ...) или четири или повече динуклеотидни повторения (като ATATATAT ...), защото те могат да причинят погрешно отпечатване. Проектирайте грундове без хомология вътре в грунд (повече от три основи, които се допълват в рамките на една самият грунд) или междугрундова хомология (където предният и обратният грунд имат допълващи се последователности). Това може да причини самодимери или праймери, при които праймерите се свързват със себе си, вместо да се свързват с желаната ДНК последователност.
Използвайте онлайн ресурси и уебсайтове, които подпомагат дизайна на грунда или помагат за проверка на последователността на грундовете за самодопълване или потенциал за създаване на вторични структури като фиби. Някои уебсайтове за дизайн на праймери включват Primer3 на Масачузетския технологичен институт, OligoAnalyzer на Националния център за биотехнологична информация Primer-Blast и Integrated DNA Technologies.