Трис или трис (хидроксиметил) аминометан е общ биологичен буфер, използван през целия процес на екстракция на ДНК. По време на извличане от произволен брой източници, ДНК е чувствителна към рН. По време на клетъчен лизис, отстраняване на нежелани клетъчни компоненти и утаяване, трис се използва за поддържане на стабилно рН. Освен това, той играе особено важна роля в лизиса на клетките.
TL; DR (твърде дълго; Не прочетох)
ДНК екстракцията е чувствителен към рН процес и използването на трис буфер помага да се поддържа рН стабилно при лизис и екстракция на клетките.
Трис като буфер
Тъй като рН може да влияе и да бъде повлиян от редица клетъчни фактори, поддържането на стабилно рН е от съществено значение за експерименталната наука. Биологичните буфери, като трис, са важни, тъй като те могат да поддържат стабилно рН въпреки влиянията, които иначе могат да променят рН. Трис (хидроксиметил) аминометанът с рКа 8,1 е ефективен буфер между рН 7 и 9. Поради своя неутрален обхват, tris е често използван буфер в биологичните лаборатории. Трис буферът обаче е чувствителен към температура и трябва да се използва при температурата, при която първоначално е бил pH, за да се избегне неточност.
Лизис на клетките
Лизисът или отварянето на клетките е първата стъпка от екстракцията на ДНК. Това се постига чрез буфер, съдържащ трис и EDTA (етилендиаминтетраоцетна киселина). EDTA свързва двувалентни катиони като калций и магнезий. Тъй като тези йони спомагат за поддържането на целостта на клетъчната мембрана, елиминирането им с EDTA дестабилизира мембраната. Tris е основният буферен компонент; неговата основна роля е да поддържа рН на буфера в стабилна точка, обикновено 8,0. Освен това, трис вероятно взаимодейства с LPS (липополизахарид) в мембраната, служейки за дестабилизиране на мембраната по-нататък.
Tris Защитава ДНК от смяна на pH
Когато клетките се разпаднат, тяхната ДНК и съдържанието се разливат в буфера. Освен това често се включват RNase A (унищожава RNA), протеази (унищожава протеини) и SDS (натриев додецил сулфат, разтваря мембранните фрагменти). Взети заедно, тази супа от клетъчно съдържание и фрагментирана РНК и протеини може да окаже голямо влияние върху рН на разтвора. Тъй като ДНК е чувствителна към pH, за tris е важно да буферира супата и да поддържа pH в стабилна точка.
ДНК утаяване
В последния етап на екстракция на ДНК самата ДНК се извлича от разтвора. В този момент ДНК е разтворима в буфера. За да се извлече от разтвора, ДНК се прави неразтворима чрез добавяне на етанол или изопропанол (изопропилов алкохол). Когато това се направи, ДНК става очевидна в разтвор като бяло вещество. Въпреки че ДНК може да бъде изолирана от останалите клетъчни компоненти по този начин, тя не е „използваема“, когато е неразтворима. След изолирането алкохолът се отстранява и ДНК трябва да се върне в биологичен буфер, като трис, за да се използва.
Направи го сам
Въпреки че извличането на ДНК обикновено се извършва в изследователски лаборатории, като обикновено се използва един от редица налични в търговската мрежа комплекти, всеки може да направи екстракция на ДНК у дома, използвайки обикновени предмети от бита и зелено грах или спанак. В този случай трис, нито какъвто и да е биологичен буфер, не присъства, за да предпази ДНК от изместването на pH. Това обаче е визуален начин да се помогне на учениците да се свържат с клетъчната ДНК.