Генетичният план на клетката е кодиран в нейния генетичен материал или ДНК. Тъй като ДНК никога не напуска ядрото на клетката, за да може тази информация да попадне в цитоплазмата къде другаде протеини и биохимични компоненти, е необходимо първо да се транскрибира ДНК в информационна РНК (иРНК или поли (А) РНК). След това тази иРНК се превръща в протеини, които изпълняват много функции на клетката. За да се открият или изчислят количествено много редки иРНК, да се направят сонди за микрочипове или да се създадат библиотеки от допълнителни ДНК молекули, тРНК трябва да се изолира. Въпреки това, екстракцията на общата РНК (т.е. цялата РНК в клетката) и последващото изолиране на иРНК не са взаимно изключващи се процеси; първото трябва да се извърши, за да може да се извлече иРНК.
TRIzol хомогенизация: Общата РНК включва всички иРНК, трансферна РНК, рибозомна РНК и други некодиращи РНК. За да се отделят тези от другите клетъчни компоненти, клетката първо се отваря, за да я освободи съдържание. Това се прави чрез ресуспендиране на клетки, гранулирани чрез центрофугиране (въртене с висока скорост) в TRIzol Reagent (Life Technologies). Други версии на TRIzol (като TRI Reagent на Ambion) работят по подобен начин.
Общо изолиране на РНК: Използва се серия от центрофугиране за разделяне на различните компоненти (протеини, ДНК, РНК) на клетката на слоеве или фази в суспензията. Горната, жълто оцветена фаза се състои от мазнини и може да се изхвърли. Желаната фаза е оцветена в червено, съдържа общата РНК и се задържа. След извършване на фенол-хлороформ екстракция и поредица от измивания с алкохол с използване на изопропанол и етанол, РНК може да се гранулира за изолиране на иРНК. Добавете инхибитори на RNase, за да предотвратите разграждането на този ензим от общата РНК.
Извличане на иРНК: Често се използва комплект за изолиране на иРНК, тъй като домашно приготвените лабораторни протоколи не генерират големи количества на силно пречистени иРНК. Търговските комплекти включват FastTrack 2.0 на Invitrogen или Poly (A) чиста иРНК изолация на Ambion’s Комплект. Тези основни стъпки са общи за такива комплекти:
г) Центрофугирайте тази проба и възстановете супернатантата, който се промива няколко пъти в поредица от свързващи и ниско солеви буфери, осигурени в комплектите.
Препратки
- „Протоколи за библиотека на cDNA?“; Ян Г. Коуел и Каролайн А. Остин; 1997
- „In vitro транскрипция и протоколи за превод?“; Мартин Дж. Тимс; 1995
Съвети
- Поддържайте всички реактиви, клетки и РНК на студено чрез потапяне в лед. Това предотвратява разграждането на РНК от други ензими, които се освобождават по време на хомогенизационния процес.
Предупреждения
- Реагентите като TRIzol са токсични и не трябва да влизат в контакт с кожата или лигавиците. Винаги спазвайте безопасни лабораторни протоколи, когато боравите с този реагент.
за автора
Палмър Оуюнг е магистър по международен бизнес от Калифорнийския университет в Сан Диего и Бакалавър по социология от Калифорнийския университет в Санта Барбара и е обучен молекуляр биолог. От 2006 г. е писател на свободна практика. В допълнение към писането, той е редовен търговец на Forex и интернет маркетинг.
Снимки Кредити
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images